去甲基化作用对胃癌细胞生物学行为及xaf1基因表达的影响
【摘要】 目的：探讨去甲基化药物5?脱氧杂氮胞苷(5?Aza?CdR)对体外培养的胃癌BGC823细胞增殖活性、细胞周期和凋亡以及对此细胞株xaf1基因表达的影响. 方法：用MTT法检测不同浓度5?Aza?CdR对细胞增殖活性的影响；PI染色和流式细胞仪检测不同浓度5?Aza?CdR处理72 h后细胞周期分布和细胞凋亡率；RT?PCR法检测用药前后xaf1基因表达的变化. 结果：用1×103，5×103，10×103 nmol/L的5?Aza?CdR处理BGC823细胞6 d后，试验组细胞增殖抑制率较对照组明显升高（P<0.05），并呈剂量依赖关系；流式细胞仪分析表明，各药物浓度处理72 h后凋亡率明显增加：试验组凋亡率分别为（4.53±0.21）%，（8.11±1.01）%和（11.56±0.86）%，与对照组(0.51±0.01)%相比较差异显著(P<0.05). 在5?Aza?CdR处理前，未检测到BGC823细胞株xaf1 基因mRNA表达，经过5?Aza?CdR处理后，xaf1 mRNA重新表达. 结论：5?Aza?CdR可抑制BGC823细胞增殖；促进细胞凋亡；使xaf1基因甲基化状态得到逆转，而重新表达.
【关键词】 5?氮?2?脱氧胞苷；xaf1基因；BGC823肿瘤细胞株；甲基化；细胞增殖；细胞凋亡
【Abstract】 AIM: To observe the effects of the demethylating agent, 5?Aza?2′?deoxyctidine (5?Aza?CdR), on the proliferation, cell cycle, apoptosis and xaf1 mRNA expression of stomach cancer BGC823 cells. METHODS: The proliferation of BGC823 cells treated by different concentrations of 5?Aza?CdR was detected by MTT assay. Assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (FCM); the change of xaf1 mRNA expression was semi?quantified by RT?PCR before and after 5?Aza?CdR treatment. RESULTS: The growth inhibitory effects on BGC823 cells were observed in a dose?dependent manner after exposure to 5?Aza?CdR at different concentrations (1×103, 5×103, 10×103 nmol/L) for different time. FCM analysis showed that the apoptosis rates in BGC823 cells ［(4.53±0.21)%, (8.11±1.01)%, (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5?Aza?CdR for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%, P<0.05］. No expression of xaf1 gene in BGC823 cells was observed, but it was expressed after 5?Aza?CdR treatment (5×103, 10×103 nmol/L). CONCLUSION: 5?Aza?CdR can inhibit the proliferation of BGC823 cells through blocking cell cycles and inducing cell apoptosis. It can also restore xaf1 gene transcription silenced by demethylation.
【Keywords】 5?Aza?CdR；xaf1；BGC823；methylation；proliferation；apoptosis
0 引言
凋亡抑制蛋白因子家族(IAP)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(BIR)结构域［1］，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP中抑制Caspase活性最强的成员. XIAP相关因子1(XAF1)是一个新近发现可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转XIAP对细胞的保护. XAF1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，XAF1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关［2］. 我们采用5?Aza?CdR对胃癌细胞株进行处理, 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及的新方法.
1 材料和方法
1.1 材料 胃癌BGC823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；RPMI?1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5?Aza?CdR（美国Sigma公司）；配制5?Aza?CdR为1 mol/L的母液，-20℃保存，使用时用RPMI?1640稀释为工作浓度. Tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(Bio?Tek公司)；Trizol(Invitrogen公司)；UV3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(Beckman Coulter公司).
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于RPMI?1640培养液中，内含100 mL/L胎牛血清、1×105/L青霉素、100 mg／L链霉素和2 mmol/L L?谷氨酰胺，置于37℃ 50 mL/L CO2的饱和湿度箱中培养，每3～4 d消化传代1次. 传代时，常规消化BGC823细胞，置于75 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5?Aza?CdR的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.
1.2.2 MTT法绘制细胞生长曲线 取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100 μL)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5?Aza?CdR药液的完全培养液，每孔100 μL，每组设3个复孔；对照组加入等量PBS. 每日取出1板加入5 g/L MTT液10 μL，37℃孵育4 h后加DMSO 150 μL，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔A470 nm值，求其平均值，以A470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线,细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR). CPIR(％)=(1-实验组A470 nm均值／对照组A470 nm均值)×100％.
1.2.3 RT?PCR检测xaf1基因mRNA表达 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集细胞，Trizol一步反向法抽提细胞总RNA，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定RNA纯度，A260 nm／A280 nm在1.8～2.0之间. PCR引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56℃；Sense：5′?TGGGTGTAGGATTCTCCAGG?3′，Antisense：5′?GGTTTGCCCAAGGACTACAA?3′. 内参照GAPDH:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52℃；Sense：5′?TTCTCCCCATTCCGTCTTCC?3′，Antisense：5′?GTACATGGTATTCACCACCC?3′，上述引物由大连宝生物有限公司提供合成. 两步法RT?PCR：① 逆转录反应：20 μL反应体系含：2 μg模板RNA，0.5 g/L Oligo(dT)18，RNase?free ddH2O，5×Reaction Buffer，2×107 U/L RNase Inhibitor，10 mmol/L dNTP Mix，2×107 U/L A?MuLV RT. 70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶链反应：50 μL反应体系含：cDNA 1 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，Tap酶0.5 μL，上下游引物各1 μL，去离子水补至50 μL，GAPDH作内参照. PCR仪扩增条件：94℃变性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸5 min. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和GAPDH吸光度比值相对定量.
1.2.4 细胞周期和凋亡率检测 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为1×109个／L，700 mL/L冷乙醇－20℃固定24 h，加RNaseA至终浓度1 g/L，37℃温育30 min，加碘化丙啶至终浓度50 g／L，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测.
统计学处理:实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.
2 结果
2.1 5?Aza?CdR对细胞增殖的影响 分别用1×103，5×103，10×103 nmol/L 5?Aza?CdR处理6 d后，BGC823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的CPIR值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（P<0.05），并且随浓度的增加其抑制的量效关系显著(图1).
bP<0.01 vs对照（n=3, x±s）.
图1 BGC823细胞经5?Aza?CdR处理前后的生长曲线（略）
2.2 5?Aza?CdR对细胞中xaf1基因mRNA表达的影响 5?Aza?CdR处理前BGC823细胞系的xaf1基因mRNA不表达，在经5×103，10×103 nmol/L 5?Aza?CdR处理后，xaf1基因mRNA重新表达，10×103 nmol/L的5?Aza?CdR处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).
2.3 5?Aza?CdR对细胞周期的影响 BGC823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/L 5?Aza?CdR处理72 h后，S期的细胞数量逐渐增加，G2/M期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).
M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5?Aza?CdR分别作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/L 5?Aza?CdR分别作用24，48和72 h.
图2 BGC823细胞经5?Aza?CdR处理前后GAPDH mRNA的表达（略）
M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5?Aza?CdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/L 5?Aza?CdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).
图3 BGC823细胞经5?Aza?CdR处理前后xaf1 mRNA的表达（略）
表1 BGC823细胞经5?Aza?CdR处理72 h后细胞周期的变化（略）
aP＜0.05, bP＜0.01 vs对照.
3 讨论
DNA甲基化是由S?腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5?甲基胞嘧啶(5?mC)的化学修饰过程［3］. 近期研究表明，多种人类肿瘤在过程中表现异常DNA甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见［4］. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌［5］、结肠癌［6］、黑色素细胞瘤［7］组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5′区域CpG岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的CpG岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×103，10×103 nmol/L)的特异性DNMT抑制剂5?Aza?CdR，对体外培养的胃癌BGC823细胞进行干预，RT?PCR结果显示在5?Aza?CdR作用前，xaf1 mRNA不表达，而在5?Aza?CdR作用后，xaf1 mRNA又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明DNA甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的DNA核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的［8］. 因此我们通过5?Aza?CdR人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化肿瘤提供了理论基础.
凋亡在细胞增殖、肿瘤形成和发展中也起调控作用［9］. 我们应用不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/L)5?Aza?CdR诱导胃癌BGC823细胞后，MTT结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期分析可见S期的细胞数逐渐增加，G2/M期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于S期，而使得进入G2/M期的细胞减少，由此推断5?Aza?CdR的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制XIAP对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用［2］，xaf1也是一种新的干扰素(IFN)诱导基因，其介导了IFN诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］.
【】
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