磁激活细胞分离术检测胃癌循环血微转移的研究
【关键词】磁激活细胞分离术・胃肿瘤・肿瘤转移・游离癌细胞
Detection of blood micrometastasis with the magneticactivated cell sorting in patients with gastric cancer
【ABSTRACT】Objective:The significance of MACS(magnetic activated cell sorting)was studied for diagnosing and treating cancer micrometastasis by enriching and quantifying free carcinoma cell in peripheral and portal circulation,in gastric cancer patients with different stages.Methods:Peripheral blood samples,preoperatively collected from 23 patients with gastric cancer and 7 benign tumor volunteers,portal blood being collected during operation,were sorted by MACS;the carcinoma cells were quantified by flow cytometry and compared between different groups.Results:Carcinoma cells could rarely be detected in the samples without MACS;in the samples undergone MACS,the concentrations of carcinoma cells were significantly higher in gastric cancer group than in control group,and lower in pTNM stage Ⅰ~Ⅱ patients than in stage Ⅲ~Ⅳ patients(16/23 VS 1/7;19/23 VS 1/7;P＜0.01).The free cancer cells in portal blood were more than those in peripheral blood （1.81% VS 0.42%,P＜0.01）.Conclusion:MACS can effectively enrich epithelial tumor cells in peripheral and portal blood,close relationships can be found between carcinoma cell concentrations and tumor clinical stages.The technique colud become a valuable tool to guide evaluation of cancer metastasis risk and the strategy of chemical therapy.
【KEY WORDS】Magnetic activated cell sorting・Stomoch neoplasms・Neoplasm metastasis・Free cancer cell 恶性肿瘤临床失败以及患者死亡的重要原因之一是隐匿性肿瘤细胞播散引起的复发，而转移过程中的肿瘤细胞的检测和分离比较困难。细胞角蛋白是上皮细胞及上皮来源的恶性肿瘤细胞中间丝的组成成分［1］，被认为是检测循环中癌细胞的敏感标记物［2，3，4］。本研究尝试用磁激活细胞分离术（magnetic activated cell sorting,MACS）富集并分离胃癌患者外周血和门静脉血中的癌细胞，探讨此技术对肿瘤微转移诊断的意义，并协助选择胃癌化疗的时机和途径，以期改善预后。
1 资料与方法
1.1 一般资料 胃癌组为2001年10月~2003年10月我科收治的胃癌患者23例，男性15例，女性8例；年龄39~83岁，中位年龄67.8岁；pTNM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期3例，Ⅲ期11例，Ⅳ期3例。pTNM分期参照1997年UICC（国际抗癌联盟）恶性肿瘤的TNM分期［5］。7例胃平滑肌瘤患者作为对照组。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂 德国Miltenyi Biotec公司的Midi磁激活细胞分离系统及癌细胞富集检测试剂盒，德国Eppendorf5804R离心机，美国COULTER公司EPICS XL流式细胞仪。
1.2.2 标本采集 术前抽取外周静脉血30ml，术中于肿瘤切除前经胃网膜右静脉置管6~8cm抽取门静脉血30ml，均置于EDTA抗凝管，于采血当日进行磁激活细胞分离检测。
1.2.3 磁激活细胞分离 （1）将抽取的30ml血标本，3000r/min不间断离心30min。（2）仔细收集血清与红细胞之间雾状白细胞层约5ml，加1倍缓冲液至40ml，混匀。（3）加入5ml MACS CellPerm Solutin，混匀，室温（20~25℃，下同）5min以破坏红细胞。（4）加入5ml MACS CellFix Solution,混匀，室温30min终止反应。（5）3000r/min离心10min，去上清，加入30ml 1倍MACS CellStain Solution,混悬。（6）3000r/min离心10min，去上清，加入10ml 1倍MACS CellStain Solution混悬。（7）3000r/min离心10min，去上清，加入1倍MACS CellStain Solution混悬，最终容积600μl。（8）加200μl免疫球蛋白恒定链受体（FCR）阻断剂，混匀；加200μl MACS角蛋白磁珠，混匀，室温45min。（9）加100μl标记FITC的抗角蛋白抗体和100μl标记PE的抗CD45抗体，避光，室温15min。（10）加4ml 1倍MACS CellStain Solution,3000r/min离心10min，去上清，细胞混悬于1ml 1倍MACS CellStain Solution。（11）上述混悬液取1/2直接送流式细胞仪检测。（12）用缓冲液冲洗磁柱。（13）经滤器加入剩余1/2细胞悬液，用1ml缓冲液冲洗 3次，收集未标记磁珠的细胞。（14）加1ml缓冲液，用针芯快速推挤，压出磁珠标记细胞于另一试管。
1.2.4 结果判断与分析 以CK+CD45-细胞为阳性细胞将上述标本分别送流式细胞仪分析，计数标本中CK+CD45-细胞比例。
1.3 统计分析 四格表精确法χ2检验和t检验，使用SPSS 10.0 for Windows统计软件分析。所有计量资料以x±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 MACS前后检测结果 MACS前胃癌组23例中有7例外周血和门静脉血均发现阳性细胞，外周血阳性细胞比例为0.03%~0.22%（0.10%±0.07%），门静脉血为0.08%~0.35%(0.14±%0.11)。对照组均未发现阳性细胞。
MACS后结果，（1）对照组：7例中阳性细胞占检测细胞总数的0%~0.15%，其中5例未发现阳性细胞，1例外周血、门静脉血阳性细胞为0.05%，1例外周血、门静脉血阳性细胞为0.15%。（2）胃癌组：胃癌患者外周血、门静脉血都发现阳性细胞。①外周血：阳性细胞比例为0.05%~0.76%(0.41%±0.19%),其中pTNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者阳性细胞比例为0.05%~0.34%(0.19%±0.08%)，Ⅲ~Ⅳ期患者为0.26%~0.76%(0.48%±0.27%)。②门静脉血：血阳性细胞比例为0.12%~3.49%(1.76%±0.36%),其中pTNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者阳性细胞比例为0.12%~1.07%(0.42%±0.28%),Ⅲ~Ⅳ期患者为1.02%~3.49%(1.89%±0.47%)。
2.2 外周血、门静脉血MACS前后分组比较 将对照组测得的阳性细胞比例最高值作为判定血循环中上皮源细胞的异常标准，即阳性细胞比例≥0.15%的标本定为阳性，＜0.15%的标本定为阴性。
2.2.1 两组MACS前后比较 对照组MACS前无阳性病例，MACS后1例阳性病例（1/7，P＞0.05）。胃癌组外周血MACS前3例阳性病例（3/23），MACS后16例阳性病例（16/23，P＜0.001);门静脉血MACS前5例阳性病例（5/23），MACS后19例阳性病例（19/23，P＜0.001)。
2.2.2 外周血MACS前后比较 MACS前对照组与胃癌组阳性率差别无统计学意义，MACS后差别有统计学意义（1/7 VS 16/23，P＜0.005)。胃癌组MACS后PTNMⅠ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期阳性细胞比例差别有统计学意义（0.19% VS 0.48%,P＜0.01)。
2.2.3 门静脉血MACS前后比较 MACS前对照组与胃癌组阳性率差别无统计学意义，MACS后差别有统计学意义（1/7 VS 19/23，P＜0.001）。胃癌组MACS后pTNMⅠ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期阳性细胞比例差别有统计学意义（0.42% VS 1.89%,P＜0.001)。
2.2.4 胃癌组外周血与门静脉血MACS前后比较 门静脉血与外周血MACS前阳性细胞比例差别无统计学意义（P＞0.05）；MACS后阳性细胞比例差别有统计学意义（1.81% VS 0.42%,P＜0.01)。
3 讨 论
胃癌的发生、和细胞周期调节失控密切相关［6］。恶性肿瘤在早期阶段就有肿瘤细胞脱落进入到循环系统，这些脱落的肿瘤细胞目前常用的临床诊断方法难以检测到，它们可能是导致肿瘤复发和转移的原因之一［7］。周围静脉血微转移癌细胞阳性与肿瘤不良预后密切相关［8］。目前常用的血循环肿瘤细胞检测方法，如免疫细胞化学检测、转录多聚酶链反应、定量逆转录多聚酶链反应、荧光定量逆转录多聚酶链反应和真时自动免疫酶联反应仪检测等，主要问题是不能排除假阴性和假阳性的可能，原因可能是血细胞中CK19假基因扩增或CK19基因非法扩增［9］等，操作过程中样品间相互污染、扩增产物的污染或基因组DNA的污染也可导致假阳性。RTPCR方法对标本采集和检测要求较高，需通过设置严格的对照和采用复杂的操作过程才能取得满意的结果，费用昂贵，且易有假阳性，限制了其实际应用。因此，本研究应用的磁激活细胞分离术（MACS）作为检测外周组织播散癌细胞的新技术，敏感性高，能显著提高检出率。
磁激活细胞分离术（MACS）是一种敏感性、特异性比较高的检测方法。MACS检测胃癌微转移常用标记物为细胞 角蛋白（CK）。CK是上皮细胞中间丝的成分，是上皮分化的可靠标记物。CK19在各部位腺上皮起源的恶性肿瘤中均有表达，故常作为检测血液中癌细胞的标记物。胃癌细胞属于上皮来源，所以可以用测定CK来检测游离胃癌细胞的存在。MACS检测时用包被有CK抗体的微磁珠标记上皮来源的细胞，以磁柱富集标有微磁珠的上皮源细胞，可以提高受检细胞的检出率和敏感性。另外，因部分白细胞也表达某些CK，可能造成假阳性。为此，将CK与白细胞共同抗原CD45组合，分别以抗CKFITC和抗CD45PE抗体标记肿瘤细胞和白细胞，以CK+CD45-细胞为阳性细胞（排除了白细胞干扰），用流式细胞仪进行定性、定量分析。本组实验中胃癌患者标本未经MACS直接行流式细胞仪检测时仅7/23检测出阳性细胞，比例较低；而MACS后23例患者标本均发现阳性细胞，且阳性细胞比例显著提高（外周血0.10% VS 0.41%;门静脉血0.14% VS 1.76%）。本实验结果说明，CK是一个敏感的检测血循环中游离癌细胞的标记物，而MACS是一种特异性很高且极为有效的分离富集肿瘤细胞的方法［10］。用这种技术加敏感的流式细胞仪检测可富集10000倍以上［11］。肿瘤细胞经过磁柱后不会遭到破坏，可以进行原代培养，这对实体瘤微转移的深入研究极为有利。
实验发现胃癌患者与非胃癌患者血循环中阳性细胞出现的频率存在显著差异，胃癌患者循环中上皮来源的细胞多数可能是播散的癌细胞，有发生远处转移的可能，应密切随访，以期早发现早。在非癌患者血中出现阳性细胞的原因尚有争论。Hardingham［12］认为，来自非恶性肿瘤的结肠上皮在病理状态下也可能进入血流中。本实验在对照组中有1例阳性细胞达0.15%。为了减少假阳性的出现，我们将阳性细胞比例0.15%作为阳性结果的判定标准。
本研究还发现门静脉血中癌细胞率明显高于外周血，可能胃癌细胞脱落入血首先进入门脉循环，进而进入体循环。对有阳性发现者可术中经门静脉系统注射化疗药物，以提高疗效，延长生存期。鉴于癌细胞间断释放入血，实际的血循环癌细胞阳性率可能高于单次采血标本检测结果，故联合外周血和门静脉血多点检测可以提高检出率。
实验发现胃癌患者的临床分期对血循环中癌细胞的数量有显著影响。Ⅰ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期患者之间有显著差异（P＜0.01），提示临床分期越晚，脱落癌细胞进入血循环中的机会和数量就越大，肿瘤转移的可能性越大。通过MACS检测血循环中的癌细胞对判断肿瘤的进程和预后有重要的临床意义。血循环中发现肿瘤细胞与肿瘤患者无病生存期和总生存期的缩短密切相关［13］。
恶性肿瘤早期就有可能发生血液转移。肿瘤细胞自原发灶脱落，进入血循环，再穿透血管壁到继发部位“定居”（colonization），播散的癌细胞还须逃避机体的免疫监视，并在多种因子作用下刺激肿瘤血管生成才可能发展成转移性癌。因此，血循环中检测到游离癌细胞并不意味着均有远处转移，但转移的概率会大大增加。通过MACS富集血循环中的癌细胞，并用流式细胞仪作定量分析，是一种有较高实用价值且简便的检测血循环游离癌细胞的方法，可为肿瘤的微转移诊断、预后判断、选择化疗时机及途径等提供指导。微转移检测阳性可作为加强辅助化疗的指标，有助于建立个体化的治疗方案，提高患者生存率、降低肿瘤复发率，对改善预后将会产生积极的影响。但进一步提高该法的特异性，降低假阳性，仍是今后研究的方向。
参 考 文 献
［1］Kwaspen FHL,Smedts FMM,Bross A,et al.Reproducible and highly sensitive detection of the broad spectrum epithelial marker keratin 19 in routine cancer diagnosis［J］.Histopathology,1997,31:503516.
［2］Jung R,Kruger W,Hosch S,et al.Specificity of reverse trnascriptasepolymerase chain reaction assays designed for the detection of circulating cancer cells is influenced by cytokines in vivo and in vitro［J］.Br J Cancer,1998,78:1194.
［3］Bustin SA,Gyselman VG,Williams NS,et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients［J］.Br J Cancer,1999,79:18131820.
［4］Peck K,Sher YP,Shih JY,et al.Detection and quantitation of circulating cancer cells in the peripheral blood of lung cancer patietnts［J］.Cancer Res,1998,58:27612765.
［5］International Union Against Cancer.TNM classification of malignant tumors［S］.A John Wiley & Sons,INC,Publication,15th edition:5962.
［6］马晓丽，黄淑红，黄敬爱，等.CyclinB1、CDK1在胃癌中表达及其意义［J］.普通外科进展，2004,7(5):272.
［7］Wood DP,Banks ER,Humphreys S,et al.Sensitive of immunohistochemistry and polymerase chain reaction in detecting prostate cancer cells in bone marrow［J］.J Histochem Cytochem,1994,42:505511.
［8］Junch KW,Heiss MM,Gruetzner U,et al.Prognostic significance of bone marrow micrometastases in patients with gastric cancer［J］.J Clin Oncol,1996,14:1810.
［9］Krismann M,Todt B,Schroder J,et al.Low specificity of cytokeratin 19 reverse transcriptasepolymerase chain reaction analyses for detection of hematogenous lung cancer dissemination［J］.J Clin Oncol,1995,13:27692775.
［10］Bilkenroth U,Taubert H,Riemann D,et al.Detection and enrichment of disseminated renal carcinoma cells from peripheral blood by immunomagnetic cell separation［J］.Int J Cancer,2001,92(4):577582.
［11］Weihrauch MR,Skibowski E,Koslowsky TC,et al.Immunomagnetic enrichment and detection of micrometastases in colorectal cancer:correlation with established clinical parameters［J］ . J Clin Oncol,2002,20(21):43384343.
［12］Hardingham JE,Hewett PJ,Sage RE,et al.Molecular detection of bloodborne epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease［J］.Int J Cancer,2000,89:813.
［13］De Wynter EA,Coutinho LH,Pei X,et al.Comparison of purity and enrichment of CD34+ cells from bone marrow,umbilical cord and peripheral blood (primed for apheresis) using five separation systems［J］ .Stem Cells(Dayt),1995,13:524532.
