钙蛋白酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用

【摘要】  目的:研究calpain抑制剂（ALLN）对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。方法:45只雄性SD大鼠随机分为正常灌注组、缺血/再灌注组、ALLN+正常灌注组、ALLN+缺血/再灌注组和二甲亚砜+缺血/再灌注组,分别检测再灌注15 min时冠状动脉流出量（CF）和冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量，荧光分光光度计测定荧光强度来反映calpain活性，免疫印迹法检测心肌细胞calpain蛋白表达量，用流式细胞仪检测细胞内钙荧光强度和细胞凋亡率，并凋亡指数。结果：同缺血/再灌注组相比，ALLN+缺血/再灌注组CF显著增高（P<0.01），LDH漏出量、calpain活性和蛋白表达量、胞内钙荧光强度和细胞凋亡指数均显著降低（P<0.01）。结论:ALLN对离体心脏缺血/再灌注损伤有保护作用,可能与其抑制calpain活性，从而减轻calpain对细胞的损伤，减轻了细胞内钙超载有关。

【关键词】  钙蛋白酶； 缺血再灌注损伤； 钙离子； 凋亡

    钙蛋白酶（calpain）是半胱氨酸异源二聚体蛋白酶，广泛存在于包括心脏在内的各种组织细胞中，在体内calpain可被钙离子激活后对特定的底物进行限制性水解，参与了细胞增殖、分化、迁移和细胞信号传导等多种生物学功能［1］。calpain的异常激活则参与了许多神经系统疾病，如神经退行性病、外伤性脑损伤和脊髓损伤等，而对其在心脏病理条件下的作用研究不是很多。本试验利用calpain特异性抑制剂，观察其对离体大鼠心脏缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤的影响，旨在探讨calpain在I/R损伤中作用及可能的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂和仪器  calpain抑制剂(ALLN)、N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC、AMC、calpain单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的二抗、FLUO-3/AM FITC (美国Sigma公司)，Western blotting ECL发光试剂盒（美国Pierce公司），胶原酶Ⅰ型（美国Amresco公司），GAPDH单克隆抗体（上海康成生物公司），其它试剂为国产分析纯。FACSAria流式细胞仪（美国BD公司），Langendorff离体灌流装置由扬州心血管病研究所提供，荧光分光光度计（日立，F-4500），电泳仪、转膜仪及凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品。

    1.1.2  实验动物  实验动物为成年雄性SD大鼠，250～300 g，由扬州大学动物比较中心提供。

    1.2  方法

    1.2.1  离体大鼠心脏I/R模型的制备和分组  (1)模型制备：SD大鼠,3%戊巴比妥钠30 mg·kg-1及肝素500 U·kg-1腹腔注射,麻醉后无菌条件下摘取心脏,在4 ℃的Kerbs-Henseleit（K-H）液中迅速行主动脉插管并与Langendorff逆灌装置连接，用以95%O2、5%CO2达饱和的K-H液行逆行恒温恒压灌注，整个试验过程中温度控制在(37±0.5)℃、pH(7.4±0.5),灌注压90 cmH2O，并于灌注过程中持续通入95%O2、5%CO2混合气体。(2)分组：心脏复跳成功后平衡15 min随机分为以下5组，每组9只。①正常灌注组（control组）,离体大鼠心脏用K-H液灌注85 min。②I/R组,离体大鼠心脏用K-H液先灌注15 min后停止灌注30 min，然后再用K-H液恢复灌注40 min。③ALLN+control组,离体大鼠心脏用含10 μmol·L-1ALLN的K-H液先灌注15 min，后用K-H液恢复灌注70 min。④ALLN+I/R组，用含10 μmol·L-1 ALLN的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接着再用K-H液恢复灌注40 min。⑤二甲亚砜(DMSO)+I/R组，用含0.3%DMSO的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接着再用K-H液恢复灌注40 min。

    1.2.2  乳酸脱氢酶(LDH)和冠状动脉流出量(CF)的测定  收集再灌注15 min时单位时间内的CF，并应用日立全自动生化分析仪测定冠脉流出液中LDH的漏出量。

    1.2.3  心肌匀浆制备  去除心房和右心室，将剩余的心脏组织剪碎后加入10 ml·（g组织）-1匀浆液（10 mmol·L-1 NaHCO3，5 mmol·L-1NaN3，15 mmol·L-1Tris-HCl，pH 6.8），制成匀浆后离心（10 919 ×g，20 min），收集上清，分装储存于-70 ℃，以上操作均在4 ℃进行，蛋白浓度采用Bradford法测定。

    1.2.4  calpain活性测定  我们以N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC（calpain特异性作用底物）与calpain 反应释放出AMC的荧光强度来代表不同样品中calpain的活性［2］。取150 μl的心肌匀浆液，加入1 ml的反应缓冲液（145  mmol·L-1NaCl,100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.3）37 ℃水浴箱中振荡10 min,再加入150 μl的500 μmol·L-1的N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC，在37 ℃水浴箱中振荡60 min 后取1 ml加入比色皿，在荧光分光光度计上用波长为360 nm的光线激发后，测定在440 nm处发射的荧光强度。用已知浓度的AMC作标准曲线，测得的结果以ngAMC·min-1·(mg蛋白)-1表示。

    1.2.5  Western blotting测定calpain蛋白表达  取40 μg 变性蛋白(心肌匀浆液)经12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将胶转移至硝酸纤维素膜上(电压50 V，2 h)，转膜后5％脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，洗膜3次，每次10 min，洗膜后与1∶1 000稀释的calpain单克隆抗体37 ℃结合2 h，洗膜3次，每次10 min，然后用1∶4 000稀释的辣根过氧化酶标记的二抗37 ℃结合2 h，洗膜3次，每次10 min，以上的洗膜均在摇床上进行，洗膜所用液体均为PBS+0.05％Tween-20。最后用化学发光试剂ECL显色，X光胶片曝光，显影，定影。用同样的方法做内参GAPDH的Western blotting免疫印迹［一抗（1∶3 500）,辣根过氧化酶标记二抗（1∶5 000）］，X光胶片采用Bio-RAD凝胶成像系统进行扫描，并用自带的Quantity One分析软件对结果进行定量分析，各组calpain条带与各自对应的内参GAPDH的积分光密度值的比值作为结果。

    1.2.6  心肌细胞内钙离子及凋亡的测定  再灌注结束后，每组随机取3枚心脏采用酶分解法制备成年大鼠心肌细胞［3］，调整细胞浓度至2×106 ml-1，在相差显微镜下可见心肌细胞呈细长杆状，边缘光滑，横纹清晰。

    (1)心肌细胞内钙离子测定：每组样品中加入适量的FLUO-3/AM液（终浓度为5 mmol·L-1），混匀后避光37 ℃振荡30 min，去除负载液，用D-Hanks液洗涤3次，流式细胞仪参数设置激发波长488 nm，发射波长526 nm，每组样品取10 000个细胞，以平均荧光强度代表各组细胞内的钙离子浓度。FLUO-3/AM用DMSO配制，混匀后-20 ℃保存。

    (2)凋亡的测定：按照Annexin-Ⅴ-FLUOS Staining KIT使用说明，取30 μl Annexin-Ⅴ染料加入到1.5 ml的结合缓冲液中，再加入30 μl PI染料，充分混匀。每个细胞样品中加入100 μl的混合染料，混匀，避光室温放置15 min。用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果判定Annexin-Ⅴ-／PI-为正常细胞，Annexin-Ⅴ+／PI-为凋亡细胞，Annexin-Ⅴ+ ／PI+ 为坏死细胞。每组样品取10 000个细胞，计算Annexin-Ⅴ+／PI-细胞数占总细胞数的百分比作为凋亡指数。

    1.3  统计方法

    数据以x-±s表示，应用SPSS11．5统计软件分析处理，并采用单因素方差检验(ANOVA)分析组间差异的显著性。若差异有统计学意义时，进一步进行两两比较(SNK法)，P<0．05表示两组间具有显著差异。

    2  结    果

    2.1  各组间再灌注15 min时CF和LDH比较

    与control组相比，I/R组和DMSO+I/R组的CF显著降低(P<0.01)，LDH显著升高(P<0.01)；ALLN+I/R组与I/R组比CF显著升高(P<0.01)，LDH显著降低(P<0.01)，与control组比，差异仍有统计学意义(P<0.01)；此外，DMSO+I/R组与I/R组，ALLN+control组与control组之间CF、LDH差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。表1  各组再灌注15 min时CF和LDH比较

    2.2  各组间calpain活性比较

    I/R组calpain活性为0.365 5±0.001 7，明显高于control组的0.136 0±0.002 2(P<0.01）、ALLN+control 组的0.121 4±0.001 4(P<0.01)、ALLN+I/R组的0.154 7±0.003 0(P<0.01),而与DMSO+I/R组的0.362 8±0.002 1之间差异无统计学意义(P>0.05)。而control组与ALLN+control组、ALLN+I/R组之间差异均有统计学意义（P<0.01）。见表2。表2  各组calpain活性及calpain蛋白表达的比较

   

 2.3  各组间calpain蛋白表达比较

    I/R组calpain/GAPDH（2.34±0.20）明显高于control组（0.73±0.13）、ALLN+control组（0.64±0.07）和ALLN+I/R组（1.19±0.14)，均为P<0.01;ALLN+I/R组虽显著低于I/R组，但与control组仍有统计学差异（P<0.01）;control组与ALLN+control组、I/R组与DMSO+I/R组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。蛋白印迹结果见图1。

    1. control组；2. ALLN+control组;

    3. ALLN+I/R组；4. I/R组;

    5. DMSO+I/R组

    图1  各组大鼠心肌calpain和

    内参GAPDH蛋白印迹

    Fig 1  The protein blot of calpain and

    GAPDH in all groups

    2.4  各组间细胞内钙离子浓度比较

    I/R组与DMSO+I/R组明显高于其他各组（P<0.01），但它们两组之间无明显差异（P＞0.05）;ALLN+I/R组虽显著低于I/R组，但与control组比较仍有统计学差异（P<0.01）;control组与ALLN+control组之间无明显差异（P＞0.05）。见图2。

    2.5  各组间细胞凋亡指数的比较

    与I/R组相比，control组、ALLN+control组和ALLN+I/R组的细胞凋亡指数均显著降低（P<0.01）;DMSO+I/R组与I/R组相比无明显差异（P＞0.05）; ALLN+I/R组虽显著低于I/R组，但与control组相比仍有统计学差异（P<0.01）;control与ALLN+control组之间无显著差异（P＞0.05）。见图3。

    3  讨    论

    心肌I/R损伤一直是临床和基础研究的热点,其发生机制可能与再灌注期自由基生成过多、钙超载、微血管损伤和能量生成不足等有关，其中钙超载可通过以下机制引起心肌细胞功能障碍：(1)导致线粒体功能障碍。(2)引起心律失常。(3)使肌原纤维挛缩、断裂。(4)激活许多钙依赖的酶系统，如磷脂酶，可促进膜磷脂水解，造成细胞膜及细胞器质膜受损，此外还可激活calpain,后者是半胱氨酸异源二聚体蛋白酶，其家族包括具有组织特异性的n-calpain和非组织特异性的μ-calpain 和m-calpain。 其中μ-calpain 和m-calpain分布广泛且生化和催化特性十分相似，但两者激活表现半最高活性所需钙离子浓度不同，前者需1～20 μmol·L-1,后者需250～750 μmol·L-1。calpain活性主要受calpain-激活蛋白，calpain-抑制蛋白（calpastatin）、钙离子、PKA的磷酸化以及亚硝基化调节［4-5］。

    本试验中我们利用离体心脏Langendorff灌流模型，测量了再灌注15 min时的CF和冠脉流出液中LDH的漏出量，并利用流式细胞仪测定细胞内钙水平和细胞的凋亡程度，从而综合评价心脏损伤程度。结果发现，I/R组较control组损伤明显，证实我们离体大鼠心脏I/R模型构建成功，若在I/R前预先使用10 μmol·L-1的ALLN可明显减轻I/R所致的损伤，但与control

组仍有差异，这些提示ALLN通过抑制calpain活性，一定程度上减轻了I/R所致的细胞坏死和凋亡，这与国外一些研究是相符的。Barta等［6］试验发现心肌纤维组成蛋白和骨架蛋白均可被calpain降解，其中相对分子质量为284 000的胞衬蛋白(fodrin)和相对分子质量为3 000 000～3 300 000的肌联蛋白（connectin）对calpain最敏感，所有这些蛋白的水解都将损伤心脏功能，而ALLN可减轻这种损伤。Chen等［7］通过实验证实了［Ca2+］i的增加可以激活calpain，后者水解Bid形成tBid(截短的Bid)，促使了BAX/BAK易位和寡聚化，促使细胞色素c的释放，而ALLN可以阻止Bid活化所造成的细胞凋亡。

    为进一步研究calpain在I/R中的作用，我们利用calpain特异性荧光底物以及免疫印迹法分析了各组calpain活性和蛋白表达情况，结果发现calpain活性在I/R组明显高于control组，而预先使用ALLN可使calpain活性明显降低，但令人惊奇的是，该组细胞内钙水平较I/R组也显著降低，此前Armstrong等［8］试验发现,激活的calpain可以蛋白水解肌浆网膜骨架上的α-fodrin，从而增加肌浆网的脆性，这些在再灌注的前几分钟持续恶化，使肌浆网对心肌细胞内钙的处理能力趋于崩溃，最终导致细胞内钙超载的发生。由于心肌肌浆网是控制心肌细胞内钙稳态的关键环节，结合相关［9］及我们的试验结果，我们提出以下假设：在I/R损伤中，细胞内calpain激活后发挥其蛋白酶的功能，损害肌浆网的功能，造成细胞内钙转运的失调，加重钙超载，而增加的钙离子又可以进一步激活calpain，从而形成一恶性循环，而ALLN可以打断这种循环，一定程度缓和了钙超载，从而保护了细胞，这方面我们将在下一步试验中继续研究。

    关于calpain蛋白表达情况，实验结果发现calpain蛋白量与活性相一致，这提示在I/R损伤中calpain蛋白表达是增加的。此外为排除溶剂DMSO对试验的影响，我们增加DMSO+I/R组，其各项指标与I/R组相比无明显差异。

    综上所述，我们认为10 μmol·L-1ALLN可一定程度缓和I/R引起的细胞坏死和凋亡，作用机制可能与其抑制calpain活性，从而减轻calpain对细胞的损伤，维持了细胞内钙稳态有关。

【文献】
  ［1］SAEZ M E,RAMIREZ-LORCA R,MORON F J,et al.The therapeutic potential of the calpain family: new aspects ［J］. Drug Discov Today,2006，11(19-20):917-923.

［2］CHEN M,WON D J,KRAJEWSKI S, et al. Calpain and mitochondria in ischemia/reperfusion injury［J］. J Biol Chem,2002,277:29181-29186.

［3］BUGAISKY L B,ZAK R.Differentiation of adult rat cardiac myocytes in cell culture［J］.Circ Res,1989,64(3):493-500.

［4］SANADA S,ASANUMA H,TSUKAMOTO O, et al. Protein kinase A as another mediator of ischemic preconditioning independent of protein kinase C［J］. Circulation，2004，110:51-57.

［5］CHOHAN P K,SINGH R B,DHALLA N S,et al. L-arginine administration recovers sarcoplasmic reticulum function in ischemic reperfused hearts by preventing calpain activation ［J］. Cardiovasc Res,2006,69(1):152-163.

［6］BARTA J,TOTH A,EDES I,et al.Calpain-1-sensitive myofibrillar proteins of the human myocardium［J］.Mol Cell Biochem,2005,278(1-2):1-8.

［7］CHEN X,ZHANG X,KUBO H,et al.Ca2+influx-induced sarcoplasmic reticulum Ca2+overload causes mitochondrial-dependent apoptosis in ventricular myocytes［J］.Circ Res,2005,97(10):1009-1017.

［8］ARMSTRONG S C,SHIVELL L C，GANOTE C E. Sarcolemmal blebs and osmotic fragility as correlates of irreversible ischemic injury in preconditioning isolated rabbit cardiomyocytes［J］. J Mol Cell Cardiol，2001,33:149-160.

［9］SINGH R B,CHOHAN P K,DHALLA N S,et al.The sarcoplasmic reticulum proteins are targets for calpain action in the ischemic-reperfused heart［J］. J Mol Cell Cardiol,2004,37(1):101-110.