细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复软骨缺损的实验研究
【摘要】 通过将骨髓间充质干细胞（MCSc）诱导的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞接种到三维多孔β－磷酸三钙(β-TCP) 生物陶瓷支架材料上，体外构建骨软骨复合体，探讨以β-TCP 为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性。［方法］将β-TCP 多孔陶瓷加工成圆柱状，并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上分别接种从犬骨髓干细胞培养成的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞，将细胞-支架复合体共同培养1周后，移植到犬关节软骨缺损处。植入后12、16周末取材，进行大体观察、组织学及组织化学等观察。［结果］复合体体内移植后，在犬关节软骨缺损处有新生软骨形成，形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。［结论］β-TCP 多孔陶瓷可作为支架材料，复合细胞后具有修复软骨缺损的作用。
【关键词】 组织工程 生物陶瓷 软骨修复 软骨细胞 成骨细胞
Abstract ［Objective］To evaluate the feasibility of repairing cartilage defect with tissue-engineered cartilage ,which was made of chondrocytes and osteoblast seeded onto a biodegradable porous bioceramic β-tricalcium phosphate (β-TCP)?［Method］ A porous bioceramic template of β-TCP was created in the shape of a circular cylinder? Chondrocytes and osteoblasts induced from dog bone marrow stem cells were seeded onto the β-TCP and then kept them growing together for 1 week prior to transplantation into the cartilage defects? After 12 , 16 weeks ,the specimens were harvested and examined macroscopically, histologically and immunohistochemically? ［Result］ Gross morphological and histological analysis of the specimens from the β-TCP complex demonstrated new cartilage construction? The result was better than that in control group? ［Conclusion］ These findings suggest that porous bioceramic (β-TCP) is a good“matrix”for chondrocytes and osteoblasts, and can be used for cartilage engineering?
Key words：tissue engineering;bioceramic;repair of cartilage;chondrocyte; osteoblast
关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病，软骨损伤的修复一直是关节外科的一个难题。20世纪80年代以来，组织工程技术的迅速，为这一难题的解决提供了一种可行性的方法［1］。作者采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（MCSc）为种子细胞，将其诱导为成骨细胞和软骨细胞，与β-磷酸三钙多孔陶瓷（β-TCP）复合培养后，移植到犬关节软骨缺损处，通过组织学及组织化学等观察，以了解和评估其软骨修复性能。
1材料和方法
1?1材料及仪器
（1）DMEM 培养基等试剂为Gibco 公司产品。（2）β-TCP 多孔陶瓷材料:由上海贝奥路生物材料有限公司提供。材料平均孔径为400~600 μm,孔隙率为75%±10%，气孔沟通率达100%。
1?2方法
1?2?1MSCs的提取及诱导培养
自比格犬股骨大转子下穿刺抽取约7 ml骨髓，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，用含10%胎牛血清和青霉素及链霉素的L-DMEM培养液在37 ℃、5%CO2、 95%相对湿度的培养箱中培养。4 d后分别换含软骨细胞诱导因子、成骨细胞诱导因子的条件培养液继续培养。成骨细胞诱导因子的组成：地塞米松10nmol／L，β-甘油磷酸钠10 mmol／L，维生素C 50 mg／L；软骨细胞诱导因子的组成：转化生长因子β110 ng／L，胰岛素10 u／ml，地塞米松100 nmol／L。1?2?2Ⅱ型胶原免疫组化
在细胞诱导培养的第14 d，应用Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（购于武汉博士德公司）在细胞爬片上染色并阳性细胞数。
1?2?3碱性磷酸酶染色
采用Gomori法，将无菌玻片放入培养皿中，待细胞长至半汇后取出，PBS冲洗后用冷丙酮固定10 min，蒸馏水冲洗数次；置于孵育液中（组成：3%β-甘油磷酸钠5ml，2%巴比妥钠5 ml，蒸馏水10 ml，2%CaCl210 ml，2% MgSO41 ml），37 ℃孵育4~6 h，自来水再冲洗数次；2%硝酸钴中浸3~5 min，蒸馏水再冲洗数次；1%的硫化铵中浸泡2 min，自来水冲洗，干燥，封固，光镜下观察。
1?2?4矿化结节染色
采用茜素红法，培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗3次；加入少量0?1%茜素红-Tris-HCL(PH8?3)，置于37 ℃培养箱中30 min后，蒸馏水冲洗，干燥，封片，光镜下观察。
1?2?5体外构建细胞-生物陶瓷复合体
含软骨细胞诱导因子条件培养液培养BMSCs至14 d，取1 ml细胞悬液（含细胞2×107个）接种到β-TCP支架上，形成上端为软骨细胞的复合体，培养1周后，将1 ml成骨细胞诱导因子条件培养液培养BMSCs至14 d的细胞悬液（含细胞2×107个）注入软骨细胞-生物陶瓷复合体下端，形成软骨细胞-成骨细胞-β-TCP复合体(骨软骨细胞生物陶瓷复合体)，复合体培养1周后，行扫描电镜观察细胞贴附情况。
1?2?6骨缺损的建立及复合体的植入
比格犬15只，体重10~12 kg。用外径为6mm的环锯与股骨纵轴及矢状轴垂直方向在股骨髁最宽大处制成直径为6 mm，深10 mm的腔隙性缺损，根据植入骨类型分为三组：Ⅰ组：软骨缺损处植入软骨细胞-成骨细胞-β-TCP复合体；Ⅱ组：缺损处全层植入软骨细胞-未诱导分化组的MSCs -β-TCP复合体；Ⅲ组：空白对照，不植入任何材料。
于材料植入后的第12周、16周分两批处死动物，第1批每组2只动物，第2批每组3只动物，取材包括股骨下端的关节面，行镜下组织学观察及关节软骨缺损的组织学评分。
2结果
2?1细胞转化结果
2?1?1Ⅱ型胶原免疫组化结果
诱导培养后第14 d，MSCs定向分化为软骨细胞的阳性表现为细胞浆内棕黄色细密颗粒。光镜下MSCs细胞的胞浆染成黄色或棕黄色为阳性信号。A组细胞阳性染色，B组:有少许阳性细胞。在20×10视野下，每张爬片平均阳性细胞数见表1。
表1Ⅱ型胶原免疫组化阳性细胞数（个／视野）组别标本数阳性细胞数A组(加软骨细胞诱导液组)523?53±3?75B组（对照组，只加培养基）55?49±2?94A组与B组比较 ：t=4?73 有显著性差异 P＜0?05
2?1?2碱性磷酸酶（ALP）染色
成骨细胞具有合成分泌ALP功能，功能活跃的成骨细胞ALP组织化学染色呈阳性反应。采用钙钴法，如图1a。
2?1?3矿化结节染色
成骨细胞具有体外矿化的特征，培养细胞可形成肉眼可见的白色矿化结节， 采用茜素红法染色显示。如图1b。
2?1?4骨软骨细胞复合体培养1周后，行扫描电镜观察细胞贴附情况，分别显示软骨细胞、成骨细胞在β-TCP支架上粘附、伸展和增殖良好。如图2a，2b。
2?2犬股骨髁骨缺损修复的组织学观察
术后12周：Ⅰ组，缺损区形成透明样软骨组织，比周围正常软骨偏厚，软骨细胞数量多，出现明显的，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，软骨基质染色较四周淡，软骨下骨丰富。 Ⅱ组，边缘区厚度与周围正常软骨接近，软骨细胞排列不规则，与周围软骨结合可，无明显裂隙存在。近中央区仍以纤维组织修复为主，细胞数很少，局部有裂隙。Ⅲ组 表面为纤维组织，细胞成分较少。
术后16周：Ⅰ组，缺损区软骨厚度较正常软骨组织厚，细胞排列好，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好，如图3a；Ⅱ组，边缘修复区较正常软骨组织薄，软骨细胞排列不规则，中央区以纤维修复为主，如图3b；Ⅲ组，缺损区内主要为纤维组织，如图3c。
2?3组织学评分结果比较
软骨缺损修复的组织学评分标准见表2，12周、16周后各组软骨修复组织学评分结果如表3，说明Ⅰ组组织学评分明显优于Ⅱ组和Ⅲ组，表现在细胞数量多，软骨组织生长快，基质丰富，表面光滑，与周围正常软骨组织整合好。
表2关节软骨缺损修复的组织学评分标准分值 细胞形态基质染（着色度）表面修复情况(占修复表面的面积)软骨厚度（与周围正常软骨比较）与周围宿主的整合度0透明软骨正常（与周围宿主正常软骨比较）光滑（＞3/4）＞2/3两侧均有界限1大部分为透明软骨轻度减退中度光滑(＞1/2-3/4)1/3-2/3一侧无界限2大部分为纤维软骨明显减退不规整（1/4-1/2） ＜1/3两侧均无界限3仅有少量软骨无染色＜1/4－－4无软骨－－－－表3各组软骨修复组织组织学评分结果组别标本数时间12周末16周末Ⅰ56?5±0?354?2±0?12Ⅱ59?8±0?417?5±0?23Ⅲ513?2±0?2610?5±0?42表明：各时间段Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组比较均有显著性差异，P＜0?05
3讨论
关节软骨损伤难以自身修复，曾经采用过的方法［2］，包括关节灌洗术和关节清理术、骨髓刺激技术（磨削关节成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术）、自体或异体软骨膜和骨膜移植等，但是，以上方法疗效都很有限，修复组织也多以纤维软骨为主，缺乏正常透明软骨的力学性能及耐用性，并且经常发生并发症［3］，组织工程学的有望解决这一难题。图1a 成骨细胞碱性磷酸酶染色（钙钴法）显示犬成骨细胞胞质内灰黑色颗粒或块状沉淀（200×）
图1b矿化结节茜素红染色，显示不同形态矿化结节（40×）图2a 软骨细胞－支架复合体扫描电镜（100×）图2b成骨细胞－支架复合体扫描电镜（ 100×）图3aⅠ组缺损区软骨下骨结合紧密，潮线形成，与周围软骨组织融合好图3bⅡ组缺损由纤维组织修复，细胞排列规律，与软骨下骨结合尚可，局部有裂隙图3cⅢ组缺损部分由纤维组织修复，排列杂乱，见分泌基质3?1种子细胞的选择
种子细胞的获取是组织工程技术构建软骨的基础。理想的种子细胞应具备以下特点：（1）取材方便，对供体损伤小，来源充足；（2）体外培养增殖能力强，能持续保持细胞表型不变；（3）植入人体后能适应受区环境，并保持或恢复原有细胞的功能。目前，最常用的种子细胞有间充质干细胞 (MSCs)、胚胎干细胞 (ESCs) 和自体软骨细胞。
MSCs在适宜的条件下分化成骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪、骨髓基质等，具有典型的干细胞特点，终身存在于骨髓和其他组织器官中，负责组织的修复和更新［4］。MSCs可从患者自体骨髓穿刺获得，操作简单，并发症少，可避免产生免疫排斥反应，其传代增殖能力很强，多次传代仍可保持良好的增殖分化活性，在体外培养过程中始终保持多向分化潜能，但体内含量少，因此在植入人体前需体外培养扩增。ESCs也具有多向分化潜能，经定向诱导和分化，可获得无免疫排斥性的软骨细胞，但是，使用ESCs 作为种子细胞存在着伦问题，并且，种植于体内可形成包含三个胚层的细胞畸胎瘤，所以如何有效控制ESCs 向特定类型细胞分化有待进一步研究。自体软骨细胞可由骨关节软骨、肋软骨、骺板软骨等软骨组织分离培养获得，在严格的三维条件下培养，自体软骨细胞可以维持表型稳定达8个月之久，数量可以扩增2 000倍以上，但自体软骨细胞常规培养传代和增殖能力有限，在体外培养过程中易发生去分化现象［5］，且其活性随着患者年龄的增长而明显下降，蛋白多糖分泌减少，丧失成软骨能力。自体软骨细胞来源有限，且难以用少量的自体软骨细胞经体外培养而获得大量具有正常功能的软骨细胞，这一缺点大大限制了自体软骨细胞在关节软骨缺损修复中的临床应用。
3?2细胞因子的作用
大量研究证实生长因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白（BMP）、胰岛素样生长因子（IGFs）等对软骨细胞的增殖、代谢及干细胞向软骨细胞分化过程中发挥重要的作用［6］。TGF-β1和IGFs均可促进软骨细胞的增殖、分化和软骨基质的合成；bFGF对多种属细胞有促进有丝分裂的作用，能促进软骨细胞增殖并促使其分化，促进软骨基质合成，使修复组织更厚，并含有更多的蛋白多糖和Ⅱ型胶原；BMP可促进软骨细胞合成基质，改善软骨的修复；细胞介素（IL）-10等细胞因子也对软骨细胞的增殖代谢有保护作用［7］。
3?3合适的生物支架材料
寻找新型细胞支架材料目前已经成为软骨组织工程研究的热点之一。当前，在组织工程中可作为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点［8］；人工合成的支架材料可大规模生产，且其生物学和力学特性可根据需要进行改变。其中可降解的人工合成支架材料的生物学特征类似胶原，其多孔结构可以方便种子细胞的长入，且其降解性避免了取出移植物的手术损伤。生长因子和其他一些药性刺激因子同样可以涂于支架上面以刺激细胞增殖和分化。
在本实验中作者选用的材料是β－TCP多孔陶瓷，该材料具有良好的生物相容性和生物降解性，机械强度高，孔径大小适合细胞长入，体内完全降解时间为4个月左右。以该材料为支架接种软骨细胞和成骨细胞，体外构造骨软骨复合体，在体内成功地培养出具有三维立体形态及组织学特征良好的新生软骨组织，表明β-TCP多孔陶瓷是软骨细胞和成骨细胞较为适宜的载体材料，其微结构适宜新生软骨的形成。
研究结果表明，MSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞，β-TCP支架是理想的软骨组织工程支架材料。MSCs经向软骨细胞、成骨细胞定向分化后复合β-TCP 支架材料，在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。相信通过上述研究的不断完善和深入，将能够使这种新型生物性人工软骨广泛用于人体各种软骨组织缺损的修复治疗中。
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