电针对慢性应激模型大鼠肠道神经系统的影响

【摘要】  目的:探讨电针改善抑郁症引起的消化功能障碍的机制。方法:将30只Sprague Dawley雄性大鼠随机分为正常组、抑郁模型组、电针组，每组10只。采用生物化学试剂盒检测大鼠结肠组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）的含量，免疫组化SP法检测结肠组织环氧合酶-2（COX-2）的表达。结果:与正常组比较，慢性应激使模型组大鼠结肠组织iNOS和NO含量及COX-2的表达均显著升高和上调（P<0.01）;电针可以降低结肠组织iNOS和NO含量及COX-2的表达（P<0.01）。结论:电针对肠道神经系统的调整作用可能是其改善抑郁状态下大鼠消化功能的一个重要途径。

【关键词】  抑郁症.针灸疗法;大鼠;周围神经;胃肠系统;电针疗法

     抑郁症是指一种以情绪显著而持久低落为主要特征的综合征，消化功能障碍作为抑郁发作期间出现的主要躯体症状，严重损害着病人的生活质量。大量研究发现，抑郁情绪作用于中枢神经系统，并通过脑肠轴影响胃肠活动［1］ ，但是对于它对肠道神经系统的作用机制却研究不多。临床上电针对抑郁症和消化功能障碍疗效颇佳，且具有起效快、副作用小的优势。故本实验通过观察电针对慢性应激抑郁模型大鼠肠道神经系统的神经递质iNOS和NO的含量及其对COX-2的表达水平的影响来探讨电针改善抑郁症消化功能障碍的机理。

　　 1 材料与方法

　　 1.1 材料

    1.1.1 主要试剂与仪器 HANSLH202型电针仪;1寸28号华佗牌毫针;NOS分型试剂盒和NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）;羊抗鼠COX-2单克隆抗体（美国Santa Cruz生物化学有限公司）;SP超敏试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）;DAB显色剂（北京中山公司）。

    1.1.2 动物分组与模型制作 健康雄性SD大鼠（由维通利华实验动物技术有限公司提供，清洁级），体重160～180g，30只。每笼4只，自由饮食，光线，适应性喂养1周。然后随机分为3组:正常组、模型组和电针组，每组10只。除正常组正常喂养外，其余大鼠适应性喂养后运用慢性应激结合孤养的方法造模［2］ 。慢性多种应激程序每日随机安排以下一种:断食24h，断水24h，昼夜颠倒24h，夹尾3min，束缚3h，10℃冷水游泳5min，电击足底（电压为30V，电击5s，间歇5s，共进行300s），每种刺激3次，共21d。

    1.2 方法

    1.2.1 电针方法 参照大鼠选穴图谱，选取天枢、百会和印堂穴。使用HANSLH202型电针仪，电针频率为2Hz，电流强度1-3mA，每次30min，每日9.00Am1次。电针组造模同时给予，共21d。

    1.2.2 iNOS和NO的测定 实验完成后，快速断头处死大鼠，打开腹腔，取适量结肠组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，快速滤纸吸干，称重，用生理盐水作为匀浆介质制备成10%的组织匀浆，低温离心机3000r.min离心15min，取上清，iNOS和NO的检测按照相应的试剂盒说明书进行。

    COX-2表达的检测:在距肛门约7cm处取结肠组织1cm，用体积分数10%的福尔马林溶液固定，固定好的标本，常规石蜡包埋切片，采用免疫组化SP法检测COX-2的表达。操作按照试剂盒说明进行，一抗工作浓度为1:80，DAB染色，苏木素套染，以PBS代替一抗作阴性对照，以细胞核蓝色为阴性，胞浆内或核膜上呈棕黄色为阳性。每张切片选取5个400倍视野，采用IPP全自动图像分析软件，Olymps摄像系统测定阳性反应物灰度值并照片。

    1.3 统计学处理方法 实验数据以ˉx±s表示。用单因素方差分析，继以Dunnet双侧检验进行统计处理，分析组间差异，以P<0.05作为差异显著性标准。

【摘要】  目的:探讨电针改善抑郁症引起的消化功能障碍的机制。方法:将30只Sprague Dawley雄性大鼠随机分为正常组、抑郁模型组、电针组，每组10只。采用生物化学试剂盒检测大鼠结肠组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）的含量，免疫组化SP法检测结肠组织环氧合酶-2（COX-2）的表达。结果:与正常组比较，慢性应激使模型组大鼠结肠组织iNOS和NO含量及COX-2的表达均显著升高和上调（P<0.01）;电针可以降低结肠组织iNOS和NO含量及COX-2的表达（P<0.01）。结论:电针对肠道神经系统的调整作用可能是其改善抑郁状态下大鼠消化功能的一个重要途径。

【关键词】  抑郁症.针灸疗法;大鼠;周围神经;胃肠系统;电针疗法

     抑郁症是指一种以情绪显著而持久低落为主要特征的综合征，消化功能障碍作为抑郁发作期间出现的主要躯体症状，严重损害着病人的生活质量。大量研究发现，抑郁情绪作用于中枢神经系统，并通过脑肠轴影响胃肠活动［1］ ，但是对于它对肠道神经系统的作用机制却研究不多。临床上电针对抑郁症和消化功能障碍疗效颇佳，且具有起效快、副作用小的优势。故本实验通过观察电针对慢性应激抑郁模型大鼠肠道神经系统的神经递质iNOS和NO的含量及其对COX-2的表达水平的影响来探讨电针改善抑郁症消化功能障碍的机理。

　　 1 材料与方法

　　 1.1 材料

    1.1.1 主要试剂与仪器 HANSLH202型电针仪;1寸28号华佗牌毫针;NOS分型试剂盒和NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）;羊抗鼠COX-2单克隆抗体（美国Santa Cruz生物化学有限公司）;SP超敏试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）;DAB显色剂（北京中山公司）。

    1.1.2 动物分组与模型制作 健康雄性SD大鼠（由维通利华实验动物技术有限公司提供，清洁级），体重160～180g，30只。每笼4只，自由饮食，光线，适应性喂养1周。然后随机分为3组:正常组、模型组和电针组，每组10只。除正常组正常喂养外，其余大鼠适应性喂养后运用慢性应激结合孤养的方法造模［2］ 。慢性多种应激程序每日随机安排以下一种:断食24h，断水24h，昼夜颠倒24h，夹尾3min，束缚3h，10℃冷水游泳5min，电击足底（电压为30V，电击5s，间歇5s，共进行300s），每种刺激3次，共21d。

    1.2 方法

    1.2.1 电针方法 参照大鼠选穴图谱，选取天枢、百会和印堂穴。使用HANSLH202型电针仪，电针频率为2Hz，电流强度1-3mA，每次30min，每日9.00Am1次。电针组造模同时给予，共21d。

    1.2.2 iNOS和NO的测定 实验完成后，快速断头处死大鼠，打开腹腔，取适量结肠组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，快速滤纸吸干，称重，用生理盐水作为匀浆介质制备成10%的组织匀浆，低温离心机3000r.min离心15min，取上清，iNOS和NO的检测按照相应的试剂盒说明书进行。

    COX-2表达的检测:在距肛门约7cm处取结肠组织1cm，用体积分数10%的福尔马林溶液固定，固定好的标本，常规石蜡包埋切片，采用免疫组化SP法检测COX-2的表达。操作按照试剂盒说明进行，一抗工作浓度为1:80，DAB染色，苏木素套染，以PBS代替一抗作阴性对照，以细胞核蓝色为阴性，胞浆内或核膜上呈棕黄色为阳性。每张切片选取5个400倍视野，采用IPP全自动图像分析软件，Olymps摄像系统测定阳性反应物灰度值并照片。

    1.3 统计学处理方法 实验数据以ˉx±s表示。用单因素方差分析，继以Dunnet双侧检验进行统计处理，分析组间差异，以P<0.05作为差异显著性标准。

    2 结果

    电针对大鼠结肠iNOS和NO的含量及COX-2的表达水平的影响:接受慢性应激刺激后，模型组大鼠结肠组织iNOS和NO含量及COX-2的表达均显著升高和上调，模型组与正常组比较有显著差异（P<0.01）;电针干预后，结肠组织iNOS和NO含量及COX-2的表达明显下降（P<0.01）。结果见表1。表1 大鼠结肠组织iNOS和NO的含量及COX-2的表达注:*与模型组比较P<0.01;U为每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol NO为一个酶活力单位

    3 讨论

    消化功能障碍作为诊断抑郁症的症状标准之一，临床上已引起重视。本研究以电针对肠道神经系统神经递质的影响为切入点来探讨电针对抑郁状态下消化功能的调节途径和机理，希望能为临床治疗抑郁症引入一种有效、无毒副作用的治疗手段。胃肠道有一个独立的神经结构———肠道神经系统（ENS），ENS具有分泌、感觉神经元、中间神经元及支配胃肠效应器的运动神经元，在没有外来神经支配时，仍能进行完整的神经反射，故称之为“肠脑”。ENS还参与消化系统中免疫反应和炎症过程的调节 ［3］ 。

    NO在机体内既有保护作用，又有杀伤毒性与促炎作用， 这二者并不矛盾，而是体现出NO作用的时间和剂量的依赖性。iNOS为Ca2+ 非依赖型NO合成酶，在其基因被诱导因子诱导后大量表达，继而能合成大量的NO。NO是ENS中独立于交感、副交感神经的一种神经递质，NO在基础状态下对胃粘膜具有保护作用，一旦NO生成与释放受到抑制，则可以造成血管收缩，血流减少，粘膜损伤。但如果因iNOS诱导激活而产生大量的NO，则又发挥细胞毒性作用，在杀伤微生物和肿瘤细胞的同时，造成自身正常组织的损伤，引起炎症复发或持续存在。其机理是高浓度NO抑制多种与线粒体电荷传递系统、柠檬酸循环有关的酶及DNA复制的限速酶;NO与超氧阴离子作用形成过氧化亚硝基阴离子，后者分解成具有强毒性作用的羟自由基和二氧化氮自由基;过量的NO可使新生细胞的核酸亚硝基化，并破坏DNA双链［4］ 。本研究发现，抑郁症可通过上调iNOS使NO过量生成损伤肠道组织，电针可以通过下调iNOS减少NO的生成，从而减轻这种损伤。

    环氧合酶是催化花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，它分为在许多正常组织中恒定表达的原生性环氧合酶-1（COX-1）和在炎症组织中增强表达的诱生性环氧合酶-2（COX-2）。COX-2在炎症部位被快速诱导表达，产生大量的炎症性前列腺素和其他炎症介导物，如细胞因子和蛋白酶类，引起炎症反应［5］ 。COX-2还具有促癌作用［6］ ，它通过延长细胞周期G1 ，降低细胞周期蛋白D 1 水平，使细胞不能进入分裂期而持续增殖（亦不发生凋亡），细胞发生突变而异常，并使异常细胞生存时间延长，更增加了发生2次突变的机率［7］ 。COX-2本身具有过氧化物酶活性，有利于前致癌物的活化。研究显示，电针可以明显下调抑郁大鼠结肠组织COX-2的表达，抑制结肠的炎症损害。

    本实验选用慢性应激抑郁大鼠，该模型能较好的模拟抑郁症病人的某些症状和病因，主要模拟人类抑郁的核心症状———快感缺乏以及人类重型抑郁障碍的一些躯体症状表现。选取的百会、印堂、天枢穴相配伍，起到醒脑清神和调理脾胃、肠腑的作用，体现了中医治疗的整体观念。本研究发现，慢性应激使模型组大鼠下丘脑生长抑素显著下降，而血清胃泌素显著升高。通过电针治疗可以有效地升高下丘脑生长抑素和降低血清胃泌素含量，纠正这种异常分泌。

    综上所述，调节肠道神经系统的异常，是电针改善抑郁状态下的消化功能障碍的途径之一。要想更全面完整地了解电针的作用机理，需要更加深入广泛的研究。

【】
  ［1］张旭东，张春玲，周 宇.功能性消化不良与抑郁症的关系［J］.临床消化病杂志，2002，14（5）:221～222.

［2］Willner P.Validity，reliability and activity of the chronic mild stress model of depression:a10year review and evaluation［J］.Psychopharmacology，1997，134（4）:319～329.

［3］向荣成，厉有名.神经胃肠病［M］.北京:人民卫生出版社， 2001.25～26.

［4］陶 梅.一氧化氮与慢性胃病关系的研究进展［J］.陕西医学杂志，2003，6（32）:534～535.

［5］Williams CS，DuBois R N.Prostaglandin endoperoxide synthase:why two is of or ms［J］.Am J Physical，1996，270（3）:393～400.

　　［6］Marnett L J.Aspirin and related nonsteroidal anti-inflammatory drugs as chemopreventive agents against colon cancer［J］.Prev Med，1995，24（2）:103～106.