HIF?1α和VEGF的表达与肝细胞癌侵袭转移的关系

          作者：吴晓慧，王顺祥，李建坤，彭利，张萌，肖冰

【摘要】  目的探讨HIF?1α、VEGF的蛋白表达与肝细胞癌血管新生及侵袭转移特性之间的关系。方法采用免疫组化SP法检测肝细胞癌、癌旁肝组织和正常肝组织中HIF?1α、VEGF的表达，并计数MVD值。结果HIF?1α在肝细胞癌中的阳性表达率为50.0%，显著高于癌旁（16.1%）和正常肝组织的（8.3%）（P=0.001）； VEGF在肝细胞癌中的阳性表达率为80%，显著高于癌旁（59.4%）和正常肝组织（41.7%）（P＝0.044）；肝细胞癌组织中MVD值显著高于癌旁和正常肝组织（P=0.001）。HIF?1α蛋白表达与有无门静脉或胆管癌栓及肿瘤分化程度有关（P<0.05）；VEGF蛋白的表达与有无肝内或淋巴结转移及有无门静脉或胆管癌栓有关（P<0.05）。HIF?1α与VEGF表达有关（P=0.005）；HIF?1α与VEGF共同表达阳性组的MVD值显著高于共同表达阴性组MVD值（P=0.001）。结论HIF?1α可能通过调节VEGF的表达促进肝细胞癌血管新生，从而促使肝细胞癌侵袭转移。

【关键词】  肝细胞癌；HIF?1α；VEGF；MVD

    表1不同肝组织中HIF?1α和VEGF的表达及MVD值liver tissuescasesHIF?1α(%)P VEGF(%)P MVDPHCC5025(50.0)40(80.0)26.92±11.25Para?carcinoma325(16.1)*0.00119(59.4)*0.04417.08±9.31*0.001Normal liver tissue121(8.3)*5(41.7)*15.22±6.38** Compared with HCC, P<0.051资料与方法

    1.1资料收集2003年9月～2005年3月我院手术切除的肝癌标本50例，其中男36例，女14例；年龄28～73岁，平均年龄54.0岁。术后均经病理诊断为肝细胞癌，根据Edmondson分级法，其中Ⅰ、Ⅱ级29例，Ⅲ、Ⅳ级21例。另32例癌旁组织取自距肝癌组织边缘2cm以上的肝组织，12例正常组织作为对照。所有标本均用10%甲醛固定。

    1.2实验方法鼠抗人HIF?1α为美国LAB VISION公司产品，兔抗人VEGF为Santa Cruz公司产品，兔抗人VIII因子相关抗原多克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。固定好的组织标本脱水，石蜡包埋，常规病理切片，4μm厚，HE染色，由有经验的病理医师诊断核实，选取含肿瘤组织标本的蜡块，采用常规免疫组化SP法进行免疫组化检测，同时设阳性和阴性对照：阳性对照为试剂公司提供的强阳性标本切片，阴性对照采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)代替一抗。

    1.3免疫组化结果判定标准评分标准按Shimizu方法，对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记0、1、2、3分，着色阳性面积按无着色、着色<1/3、1/3～2/3、>2/3分别记0、1、2、3分，然后根据两项记分之和判断其结果：≥3分为阳性。

    1.4MVD结果判定MVD计数方法：采用Weidner[1]等的校正技术，在低倍镜（100倍）视野中，寻找新生血管最密集区，在高倍镜（200倍）视野下进行计数， 3个高倍镜视野（200倍）血管的均数即为新生血管数。

    1.5统计学方法所有数据均应用SPSS10.0统计软件进行分析。HIF?1α和VEGF蛋白表达水平的组间显著性差异采用卡方检验，MVD值的组间显著性差异采用单因素方差分析和t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    2结果

    2.1不同肝组织中HIF?1α和VEGF蛋白的表达及MVD值肝癌组织中HIF?1α阳性着色主要分布于细胞浆，小部分胞核中也有表达，分化程度越低着色程度越深，HIF?1α在正常肝组织和癌旁肝组织胞浆中无着色或着色较浅，见图1~4。VEGF主要定位在胞浆，正常肝组织中无VEGF染色或染色较浅；不同分化程度的肝癌组织VEGF染色差别不明显，见图5~8。肝癌组织微血管染色数多于癌旁和正常肝组织，见图9~11。HIF?1α和VEGF在肝细胞癌中的表达显著高于癌旁和正常肝组织（P<0.05）；肝癌组织MVD值显著高于癌旁和正常肝组织（P<0.05），见表1。

    2.2HIF?1α和VEGF蛋白表达及其与MVD的关系在肝细胞癌组织中HIF?1α和VEGF阳性表达组MVD值均显著高于阴性表达组，且HIF?1α和VEGF共同表达阳性组的MVD值高于HIF?1α和VEGF共同表达阴性组（P<0.05），见表2；HIF?1α和VEGF蛋白的表达呈显著正相关（P<0.05），见表3。表2肝癌组织中HIF?1α和VEGF的表达与MVD的关系casesMVDt PHIF?1αpositive2530.28±10.09negative2523.56±11.532.190.033VEGFpositive4029.03±10.50negative1020.07±4.842.840.007HIF?1α/ VEGFpositive2430.71±10.08negative918.30±4.293.550.001表3肝癌组织中HIF?1α和VEGF表达的关系VEGFHIF?1αpositivenegativeχ2Ppositive negative24

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    98.000.0052.3HIF?1α和VEGF蛋白表达与肝细胞癌病理特征的关系HIF?1α蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、有无肝内或淋巴结转移和AFP等无关（P>0.05），但与有无门静脉或胆管癌栓及肿瘤的分化程度有关（P<0.05）；VEGF蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、AFP及肿瘤分化程度等无关（P>0.05），但与有无肝内或淋巴结转移、有无门静脉或胆管癌栓有关（P<0.05），见表4。表4肝癌组织中HIF?1α和VEGF的表达及其与肝癌临床病理特征的关系

　　3讨论

　　缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一，缺氧状态下，细胞内缺氧反应基因（VEGF、红细胞生成素、酪氨酸羟化酶及参与糖酵解的酶类）转录和表达发生改变，从而对缺氧作出应激反应，使肿瘤细胞产生一系列适应性变化[2]。缺氧反应基因的调控主要是由HIF?1来实现。HIF?1α极不稳定，易被蛋白酶降解，常氧条件下半衰期小于10  min，但在缺氧时半衰期显著延长。HIF?1α决定HIF的活性，在肿瘤组织中广泛表达。Zhong等[3]分析179例肿瘤标本后发现，19种不同肿瘤中有13种存在HIF?1α表达。我们的研究结果显示，HIF?1α在肝细胞癌组织中的表达显著高于癌旁及正常肝组织（P<0.05），说明HIF?1α的表达与肝细胞癌的发生、有关。缺氧引起的基因表达改变可能是肿瘤生长、侵袭转移的一个关键环节[4]。宋炯等[5]研究结果表明直肠癌组织HIF?1α的表达与肿瘤Dukes分期、淋巴结转移、远处转移显著相关，而与肿瘤的病理类型、分化程度无明显相关性。李玉军等[6]发现HIF?1α与胰腺癌的浸润和转移密切相关。本研究结果显示，HIF?1α与肝细胞癌有无胆道或门静脉癌栓及分化程度密切相关，说明HIF?1α可能与肝细胞癌侵袭转移等生物学行为有关。最近发现，甲胎蛋白AFP基因也是一种对缺氧敏感的基因[7]。但是，我们的研究结果显示，HIF?1α与患者AFP值无关，可能与样本量较小有关系。VEGF是最早被发现的能为缺氧诱生的促血管生成因子[8]。目前已经明确VEGF在几乎所有的肿瘤中普遍高表达。我们的研究结果显示肝癌组织中VEGF高表达，且VEGF蛋白的表达与有无肝内及淋巴结转移、有无门静脉或胆管癌栓有关（P<0.05），说明VEGF的高表达反映了肝细胞癌侵袭转移的特性。HIF?1α阳性表达组MVD值显著高于阴性表达组（P<0.05）；VEGF阳性表达组MVD值显著高于阴性表达组（P<0.05），说明HIF?1α和VEGF均与肝细胞癌的血管新生有关。在缺氧条件下调节VEGF 表达的信号传导途径中，HIF?1的确起着关键作用。研究表明， HIF在多个层次调节VEGF 的表达，其功能包括增强VEGF 的转录活性与增加VEGF mRNA 稳定性两个方面[9,10]。本研究结果显示肝细胞癌组织中HIF?lα和VEGF表达有关。VEGF和HIF?1α共同表达阳性组MVD值为30.71±10.08，共同表达阴性组MVD值18.30±4.29，其差异有统计学意义（P=0.001），说明HIF?l可能是通过调节VEGF的表达促进肝细胞癌血管新生。

    综上所述， HIF?1α可以通过调节VEGF的表达、增加肝细胞癌新生血管的生成，促进肝细胞癌的侵袭转移。

【】
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［５］宋炯, 刘丰, 傅仲学，等. 缺氧诱导因子?1α、VEGF和MVD 在直肠癌中的表达及临床意义[J]. 实用肿瘤杂志，2004, 19(4): 314?316．

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［７］Mazure NM, Chauvet C, Bois?Joyeux B, et al. Repression of alpha?fetoprotein gene expression under hypoxic conditions inhuman hepatoma cells: characterization of a negative hypoxiaresponse element that mediates opposite effects of hypoxia?inducible factor?1 and c?Myc[J]. Cancer Res, 2002, 62(4): 1158?1165．

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