转染融合基因的DC抗肿瘤免疫效应

           作者：张文彬 张海红 孔维 查晓 陈廷清 邓碧芳 任原 黄建鸣

【摘要】  目的研究转染融合基因（GM?CSF?survivin GM?ΔSur）的树突状细胞(DC)在体外诱导高效而特异的抗肿瘤免疫效应。方法用jetPEITM?Macrophage转染体系，将构建的GM?ΔSur融合基因转染入DC，用流式细胞仪检测DC的表面分子HLA?DR、CD83、CD80、CD86 表达的高低;用LDH法测定转染融合基因的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)杀伤肿瘤细胞（HT?29和OVCAR?3）的能力。结果转染融合基因的DC细胞中可检测到GM?ΔSur融合蛋白的表达；DC表面高表达HLA?DR、CD83、CD80、CD86；PHA/rhIL?2长期培养（21d）的T细胞CD8+比例明显增加；转染融合基因的DC对HT?29肿瘤细胞的杀伤率显著高于未修饰的DC的杀伤率。结论GM?ΔSur基因转染修饰的DC能选择性诱导MHC?I类分子限制的CTL的特异性，显著提高DC的抗原提呈功能和诱导高效而特异的抗肿瘤免疫效应。

【关键词】  肿瘤; 树突状细胞; 融合基因; CTL；survivin；

　　Abstract：Objective To study the specific anti?tumor immunological effects induced by dendritic cells transfected with GM?CSF gene and survivin gene(GM?ΔSur) in vitro. MethodspcDNA 3.1 plasmid containing GM?ΔSur fusion gene was constructed and was transfected into dendritic cells by jetPEITM?Mcrophage transfected kit; cellular surface phenotype such as CD1a, CD80, CD86, CD83 were detected by FACS; The specific cytotoxicity of induced human cytotoxic T lymphocyte (CTLs) to tumor cells was detected with LDH assay. ResultsGM?ΔSur expression was detected in DC cells; High?level expression of HLA?DR, CD1a, CD80, CD86, CD83 were found in transeneed DC cells; The ratio of CD8+   cells cultured with PHA/rhIL?2 were largely increased. The lyse rate of induced CTL cells to HT?29 cell were much higher than those of blank DC cells.ConclusionGM?ΔSur gene modified DC cells could induce MHC?Ⅰspecific cytotoxic T lymphocytes and strikingly raised DC cell,s antigen present function and could induce high effective and specific anti?cancer immunological effect.   

　　Key words：Tumor；Dendritic cell; Fusion Gene; CTL; survivin

　　0引言

　　survivin基因是一种新的抗凋亡基因， 广泛表达于人的胚胎发育组织,在正常成人组织中不表达， 但在大多数肿瘤组织中表达,对肿瘤的发生、 起着重要作用， 是一个较为特异的肿瘤相关抗原（Tumor?associated antigen， TAA）基因[1]。 树突状细胞（Dendritic cell，DC）是体内重要的专职抗原提呈细胞， 直接启动和调控机体特异性的抗肿瘤免疫应答[2]。  粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子（GM?CSF）对DC的增殖分化、 细胞活力以及抗原提呈功能有着重要的调节作用[3]。 我们构建的GM?CSF?survivin融合基因表达质粒（pcGM?ΔSur）并转染人外周血来源诱导扩增的树突状细胞， 探讨转染后DC的生物学特性及诱导产生的抗肿瘤免疫效应。

　　1材料与方法

　　1.1主要试剂pcDNA3.1(-)购自invitrogen公司。HT?29细胞株、GM?CSF基因由四川康龙生物医学有限公司惠赠。survivin基因由本科室从HT?29细胞中克隆获得，经DNA测序与GenBank上收载的survivin序列一致。各种限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa公司。LDH细胞毒分析盒（Cytotox96）购于Promega公司；jetPEITM?Macrophage转染体系购自polyplus?transfection公司、人白细胞介素?4（IL?4）、GM?CSF购自晶美生物公司。CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA?DR单抗由华西肿瘤生物实验室提供。

　　1.2GM?CSF与survivin基因的连接以GM?CSF基因DNA为模板，pGM?1、pGM127为引物进行PCR扩增。以survivin为模板，Psur01、Psur02为引物进行PCR扩增。扩增DNA纯化后，BamHI内切酶37℃酶切2h，37℃ 15min热终止反应，反应物纯化后加入T4DNA ligase，16℃连接18h。GM?CSF与缺失八个氨基端氨基酸的survivin之间加入一段含三个重复氨基酸残基序列为GGGGS的肽段。利用氨基酸密码的同义突变，在连接子碱基序列的中间位置形成一个BamHI内切位点。

　　1.3pcGM?ΔSur质粒构建以上述连接物为模板，pGM?1、pSur02为引物，反应条件同。反应物经纯化后，分别经EcoRI、HindⅢ酶切。质粒pcDNA3.1(-)DNA经同样处理。酶切后纯化DNA并定量。取酶切后纯化的GM?CSF?survivin DNA  5μg，pcDNA3.1(-)质粒DNA  1μg，10U T4 DNA ligase，反应体系为20μl。16℃保温20h。取连接产物10μl转化感受态大肠杆菌DH52。接种氨苄青霉素平板。挑取克隆扩增培养，提取质粒，经PCR扩增初步获得pcGM?ΔSur阳性质粒。质粒经酶切电泳鉴定。  PGM?1：?5′GCGAATTCTAGACATGGCACCCGCCCG　CTCGCCC?3′,PGM127：?5′CCGGATCCACCGCCACCACTCCCTCCG　CCACCCTCCTGGACTGGCTC?3′; Psur01：?5′GAGGATCCGGTGGCGGAGGGAGTGGCG　CCTGGCAGCCCCTTTCTC?3′，Psur02：?5′GGAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAGC　TG?3′。

　　1.4DC的诱导扩增采集健康自愿者外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞层，用含20% NCS(小牛血清)的RPMI?1640培养液调细胞浓度为2×106/ml，制成细胞悬液。取1ml接种与24孔板中，于5%  CO2、37℃孵育2h后，吸出未贴壁的细胞备用。补加少许20%  NCS RPMI?1640使GM?CSF（1500ng/ml）和IL?4（5000U/ml），终浓度分别为150ng/ml和500U/ml，置于5%  CO2、37℃培养，每隔一天半量换液，至第7d收集DC。分别用CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA?DR单抗标记，流式细胞仪鉴定细胞表型。

　　1.5pGM?ΔSur转染DC 收集培养7天的DC,转入12孔板培养，细胞浓度为2×105/ml，分别加入GM?CSF（1500ng/ml）和IL?4（5000U/ml），至终浓度分别为75ng/ml和250U/ml；再分别加入含pGM?ΔSurDNA质粒和pcDNA质粒（对照）的转染液（jetPEITM?Macrophage）0.1ml，24h后,收集细胞，除去转染液，继续于GM?CSF和IL?4条件下培养24h，收集细胞和培养上清，提取蛋白做Western blot检测。

　　1.6转染融合基因DC转录表达的Western blot检测用甲醇?氯仿法沉淀上清中蛋白。以2×SDS上样缓冲液裂解细胞,提取pGM?ΔSurDCs中蛋白和pcDNA DCs中蛋白; Western blot按常规方法进行。

　　1.7CD8+ T细胞的诱导扩增上述未贴壁的单个核细胞悬浮于10ml  10%  NCS   RPMI?1640培养基中，加入适量PHA，于5%  CO2、37℃培养3d后，再用rhIL?2诱导扩增，每隔2d换液，至21d收集细胞，分别用CD3、CD4、CD8单抗标记，在流式细胞仪上鉴定细胞表型。

　　1.8转染GM?ΔSur融合基因DC诱导致敏CTL及其细胞毒试验上述诱导21d的CD8+ T细胞和未诱导的Naive T细胞，悬于10%  NCS  RPMI?1640培养液中，调细胞浓度为2×106/ml，接种于12孔培养板内，分别加入1×105 pcGM?ΔSur、pcDNA转染和未转染的DC细胞，再加入 rh?IL?2至终浓度为250IU/ml，于5%  CO2、37℃混合培养4~5d，作为CTL效应细胞；另取呈指数生长的H?29和OVCAR?3细胞，用培养液调细胞浓度至1×104/ ml作为靶细胞。效∶靶比按20∶1~2.5∶1比例混合，置5%  CO2、37℃培养20～24h。然后采用LDH法检测特异性杀伤率，并按下列公式特异性杀伤率：特异性细胞伤杀率(%)=[效靶OD-(效应细胞释放OD+靶细胞自然释放OD)]/[(靶细胞最大释放OD-靶细胞自然释放OD)]×100。

　　2结果

　　2.1诱导扩增DC的形态学观察及表型经淋巴细胞分离液梯度离心，从外周血获得单个核细胞，加入GM?CSF、IL?4培养24h后，可见有细胞由贴壁变为悬浮，并有少量细胞聚生，至第4~5d大量细胞聚集成团，第7d部分细胞形状不规则，高倍镜下可见有毛刺状突起，为典型的DC形态，见图1。培养第7d的DC，经FACS分析显示DC不仅表达其特异性标志CD1a（25.9%），而且高表达CD80（98.4%）、CD83（97.0%）、CD86（97.8%）、HLA?DR（16.4%）。经pcGM?ΔSur基因转染的DC同样高表达CD80（99.0%）、CD83（99.0%）、CD86（99.7%）、HLA?DR（20.8%）。

　　2.2质粒鉴定碱基序列测定：样品送北京三博远志生物技术有限责任公司进行DNA测序，结果与设计序列完全一致。

　　2.3Western blot检测GM?ΔSur蛋白表达转染pcGM?ΔSur质粒的DC可检测到融合蛋白的表达，而转染的空载体和空白对照的DC未检测到融合蛋白存在，表明转染pcGM?ΔSur基因成功，见图2。

　　1: protein marker;  2: 未转染的上清;  3: 转染的上清;4: 转染 pc DNA;   5: 转染的细胞

　　图2GM?ΔSur融合蛋白免疫印迹结果（略）

　　2.4CTL和Naive T细胞的表型表1显示，PHA和rhIL?2活化诱导的Ｔ细胞CD8+ T细胞的比例（80.3%）明显高于未诱导的T细胞（45.9%）；相反，CD4+ T细胞的比例（15.2%）明显低于未诱导的T细胞（38.1%）。

　　2.5CTL对靶细胞的特异性杀伤率结果见图3。各实验组对靶细胞的杀伤率明显高于pcDNA组、DC组，且随着效靶比的增加而升高。提示PHA/rhIL?2诱导的CD8+占优势的T细胞对HT?29和OVCAR?3瘤细胞的杀伤活性均高于NaiveT细胞，转染pcGM?ΔSur基因的DC细胞可选择性递呈survivin抗原肽给MHC?I分子限制的CD8+T细胞，诱导致敏更多的survivin特异性CTL，增强对高表达survivin的肿瘤细胞的杀伤作用。

　　表1效应细胞的表型（略）

　　图3不同效靶比下T细胞对靶细胞的杀伤率（略）
　　
　　3讨论

　　近年来利用DC疫苗人类癌症（如前列腺癌、黑色素瘤、肾癌、恶性淋巴瘤已进入Ⅱ/Ⅲ期）已取得预期效果[4]。应用相关基因修饰DC来增强机体抗肿瘤免疫成为肿瘤免疫治疗的一种新途径[5,6]。本实验在前期工作的基础上，用本室构建的pcGM?ΔSur质粒转染DC并进行抗肿瘤实验。由于survivin在肿瘤细胞表达的特异性及其抗凋亡功能，survivin已成为肿瘤免疫治疗和基因治疗的新靶点[7?10]。用survivin肽段、survivin基因和survivin mRNA来活化树突状细胞，诱导能攻击肿瘤细胞的特异CTL产生的研究已有报道[11?14]。DC在受到外来抗原刺激分化成熟期间，受包括GM?CSF等多种细胞因子的调节，GM?CSF不仅能促进DC增殖分化，而且对树突状细胞的体内分布及其抗原提呈功能都有一定的调节作用[15,16]。目前，国内外已有实验成功地将survivin基因转染至DC[17]，同时也有实验将GM?CSF基因转染至DC[18]，均取得了较好的抗肿瘤效果。本实验则期望将两种能增强DC疫苗免疫活性的基因同时转入DC内，从不同的免疫途径提高DC疫苗抗肿瘤效果。基于这种思路，我们成功地构建了pcGM?ΔSur质粒，并将该质粒转染至从外周血培养出来的DC，试图制备效果更好、持续时间更长的DC疫苗。为了最大限度的保留survivin抗原决定簇部位，同时又避免野生型survivin基因的导入可能引起的细胞抗凋亡等副作用，以及避免点突变型survivin基因导入细胞后可能发生的与染色体survivn基因的交换重组，我们构建了N端缺失7个氨基酸残基的Δ7survivin/GM?CSF基因真核表达质粒(在细胞内，survivin N端前7个氨基酸对形成survivin二聚体起了重要作用[19])，并将其转染于人外周血分离诱导的树突状细胞，观察由此诱导产生的抗肿瘤细胞免疫效应。结果证明，转染后DC保持了原有的形态、表面标志CD80、CD83、CD86、HLA?DR表达均有不同程度升高。众所周知，CD80、CD86是DC表面重要的共刺激分子，有利于DC的抗原提呈作用。体外实验表明转染融合基因后的DC更具有抗原提呈作用，转染pcGM?ΔSur质粒的DC对HT?29细胞的杀伤率明显高于未转染质粒的DC和转染空质粒的DC。本实验初步证实，转pcGMr?Sur基因的DC可选择性递呈MHC?I类分子限制的survivin抗原肽，诱导产生survivin特异性CTL，发挥特异性杀伤肿瘤细胞的作用。同时还表明将融合的GM?ΔSur基因转入DC后能显著提高DC的抗原提呈功能，体外能诱导高效的抗原免疫效应。其作用原理有待进一步探索。

【】
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