葛根黄酮提取物对HL?60细胞增殖和凋亡的影响
作者：袁怀波，糜漫天，陈宗道，魏兆军
【关键词】 细胞增殖
College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; Department of Nutrition and Food Hygene, 3rd Military and Medical University; College of Food Science, Southwest University
Abstract：Objective To investigate the effect of Kudzu flavonoids extracts on human leukaemia cancer cells HL?60 line to reveal its probable mechanism. MethodsThe survival and proliferation of HL?60 cells were determined by MTT.The cell?DNA ploidy distribution and apoptotic rate were measured by flow cytometry (FCM), and DNA ladder.The differentiation induced potence was determined by NBT. The anticancer and apoptosis potence induced by flavonoids detected by TUNEL. ResultsThere was significant inhibition of the cel1 surviva1 and proliferation of cancer cells by the extracts. An apoptosis peak appeared after treated with 3d and apoptotic rate was 38.3％, morphological change and DNA ladder of apoptosis was observed. Kudzu flavonids showed weak potent to induce differentiation. Daidzein and puerarin which regard as Kudzu flavonoids main effect ingredient have weak apoptosis induced potent, but daizein showed strong differentiation induced potent. ConclusionKudzu flavonoids could significantly inhibit growth of human leukaemia cancer cells HL?60 line through inducing apoptosis.
Key words：Kudzu；Flavonoids extracts；Apoptosis；Differentiation
摘要：目的观察葛根黄酮提取物对HL?60细胞的影响及作用机制。方法用MTT测定对HL?60细胞增殖的影响；用流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡情况；采用NBT比色法检测诱导HL?60细胞分化的能力；DNA Ladder检测HL?60细胞的凋亡特征及效果；用TUNEL检测体内诱导凋亡能力。结果葛根黄酮提取物有较强抑制HL?60细胞生长和增殖能力，处理3d可出现明显的凋亡特征，凋亡率可达38.3%，其诱导分化能力弱，葛根黄酮提取物的主要成分葛根素和大豆甙元的诱导凋亡能力弱，但大豆甙元具有较强的诱导HL?60细胞分化的能力，葛根黄酮提取物有体内诱导凋亡抗肿瘤能力。结论葛根黄酮提取物可通过诱导细胞凋亡抗人白血病HL?60细胞的生长。
关键词：葛根；黄酮提取物；凋亡；分化
0引言
葛根为常用中药，是豆科植物野葛[Pueraria lobata(Willd.)Ohwi]和粉葛(Pueraria homsonii Bentn)的肥大块根，在我国除新疆、青海及西藏外遍布全国各地。葛根中除含有约占新鲜葛根19%~20%的葛根淀粉外，主要成分为异黄酮化合物以及少量黄酮类物质，其中大豆甙元、大豆苷、葛根素是葛根的主要活性成分，尤以葛根素含量最高。近年来研究发现葛根黄酮提取物有抗氧化、抑制癌细胞增殖、诱导黑色素瘤和肝癌细胞凋亡等抗肿瘤作用[1?3]，但葛根黄酮提取物抗肿瘤的机制及主效成分还未得到揭示。本实验以人白血病HL?60细胞为研究对象，研究葛根黄酮提取物抗肿瘤的途径及其抗肿瘤的主效成分，为葛根黄酮提取物开发为抗肿瘤保健食品和药品提供理论依据。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器葛根黄酮提取物（野葛），用乙醇提取，经乙醇沉降、AB?8大孔树脂柱层析等得到纯度80％的成品，其中含葛根素25.2％、大豆甙元16.2％、三羟基异黄酮21.9％；葛根素、大豆甙元标准品购自药品生物制品检定所；RPMI1640为Hyclone公司产品；TUNEL凋亡检测试剂盒为华美生物工程公司产品；INCO2 108型CO2培养箱（德国）； 流式细胞仪FACS?440型（美国）。
1.2细胞培养实验HL?60细胞购于中科院上海细胞生物研究所，培养在RPMI1640培养液中，含10%小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，置于37℃、5% CO2细胞培养箱，常规培养传代。待细胞处于对数生长期时进行实验处理。
1.3细胞实验分组及药物处理实验设对照组（control）和葛根黄酮提取物、葛根素与大豆甙元处理组。用二甲基亚砜（DMSO）分别将葛根黄酮提取物、葛根素、大豆甙元配成100mg/ml、10-2mol/L、10-2mol/L的储存液，使用液用RPMI1640稀释到所需浓度。DMSO在各组培养液中的浓度均≤0.05％。经预实验确定葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元的处理浓度分别为50μg/ml、30μmol/L、30μmol/L。
1.4MTT比色法HL?60细胞以1×105个/ml细胞密度接种于96孔培养板中，每孔200μl，加各处理因素，培养1～3d，收获细胞前4h，每孔加入15μl MTT（5mg/ml），37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养4h，去掉培养液，加入200μl异丙醇、二甲基亚砜混合液（1∶1，v/v）。室温30min左右，用酶联仪在492nm处测OD值。
1.5流式细胞仪检测细胞周期相分布及细胞凋亡率葛根黄酮提取物处理HL?60细胞2d，收获细胞，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶（PI）染色，采用流式细胞仪检测细胞周期相分布和细胞凋亡率。
1.6DNA梯形带检测经葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元处理HL?60细胞2d后，收获细胞，加入150μl NP?40细胞溶破液（1% NP?40，20mmol/L EDTA，50mmol/L Tris·Cl pH 7.5）溶破5h，离心收集上清，取上清置于1% SDS溶液中，混匀，加入RNase A至终浓度为2μg/ml，56℃孵育2h，再加蛋白酶K至终浓度为2μg/ml，37℃水浴2h。加1/2体积的10mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，于-20℃静置，离心获得DNA沉淀。将此DNA沉淀用TE缓冲液溶解取样进行2% 琼脂糖电泳。
1.7NBT还原实验以1×105个/ml的细胞密度，将生长良好的细胞接种于培养瓶中，加处理因素培养3d后，调整细胞浓度至1×106，接种于24孔培养板，加入含1.25mg/ml NBT、17mg/ml BSA以及2μg/ml TPA的PBS缓冲液，37℃培养2h，弃去培养液，加入3ml DMSO溶解结晶物，用酶标仪在580nm处测OD值。
1.8TUNEL凋亡试剂盒检测收获HL?60细胞涂片，按凋亡试剂盒的要求进行孵育和染色，光学显微镜进行镜检观察HL?60细胞的形态变化，凋亡细胞核染色为棕黄色。
1.9统计学处理实验数据以±s表示，应用The SAS system 6.12统计软件进行统计处理和显著性检验。
2结果
2.1葛根黄酮对HL?60细胞增殖功能的影响MTT比色实验显示，葛根黄酮提取物、葛根素、大豆甙元处理HL?60细胞1～3d后，OD492值分别比对照HL?60细胞明显下降，说明葛根黄酮提取物具有较强抑制HL?60细胞增殖能力，其次为大豆甙元，葛根素最弱，见图1。
图1葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元对HL?60细胞增殖的影响（略）
2.2葛根黄酮提取物对HL?60细胞周期相分布及凋亡率的影响HL?60细胞经处理后，经流式细胞仪分析，结果显示：随着葛根黄酮提取物处理天数的增加，HL?60细胞中处于G2/M期的细胞数显著增多，S期细胞数减少，细胞凋亡率显著增加；随着葛根素和大豆甙元处理天数的增加，HL?60细胞中处于G1/G0的细胞数增加，S期和G2/M细胞数减少，细胞凋亡率增加，见表1、图2。由此看出葛根黄酮提取物可阻滞细胞周期于G2/M期，有较强的诱导HL?60细胞凋亡的能力，其诱导凋亡能力强于葛根素和大豆甙元。葛根素和大豆甙元阻滞细胞周期于G1/G0期，大豆甙元对HL?60周期阻滞能力和诱导凋亡能力强于葛根素。
表1葛根黄酮提取物、葛根素、大豆甙元对细胞周期分布和细胞凋亡的影响（略）
与对照组比P<0.05;△ 与相同处理1d组比P<0.05; ▲与相同处理2d组比P<0.05a：对照组；b：葛根黄酮提取物处理3d组；c：葛根素处理3d组；d：大豆甙元处理3d组
图2流式细胞仪分析各处理组HL?60细胞周期相分布的影响（略）
2.3葛根黄酮提取物对HL?60细胞凋亡的DNA Ladder检测HL?60细胞经处理后其细胞凋亡百分率增加（流式细胞仪检测结果），进一步通过DNA Ladder分析其凋亡能力，结果发现：正常HL?60细胞其DNA在凝胶上电泳痕迹为积聚状，而葛根黄酮提取物处理HL?60细胞后其DNA在凝胶上电泳痕迹为梯形状，随着处理天数的增加梯形带越明显，见图3。葛根素和大豆甙元处理后得到HL?60细胞DNA Ladder不明显（图略）。说明葛根黄酮提取物诱导HL?60细胞染色质DNA进行有控降解，将DNA酶切为由180～200个碱基对或其倍数的寡核苷酸片断。葛根黄酮提取物诱导HL?60细胞凋亡的能力高于其对照品葛根素和大豆甙元。
2.4葛根黄酮提取物诱导HL?60细胞分化的能力HL?60细胞经处理3d后，收获细胞，测定其NBT还原力，结果显示：经处理后HL?60细胞的NBT还原力上调，且表现为大豆甙元的诱导能力强于葛根素，而葛根黄酮提取物的能力最弱，见图4，说明葛根黄酮提取物的诱导分化能力最弱，而大豆甙元具有强的诱导分化能力。
图3DNA 梯形带检测葛根黄酮处理HL?60细胞诱导凋亡能力（略）
* 与对照组比P<0.05; **与对照组比P<0.01
图4葛根黄酮提取物诱导HL?60 细胞分化能力（略）
2.5诱导凋亡的原位检测葛根黄酮提取物有诱导HL?60细胞凋亡的能力，见图5。对照组肿瘤细胞体积较大且胞浆丰富，鲜见染色为棕黄的细胞核；随着葛根黄酮处理HL?60细胞天数的增加，呈棕黄色细胞核的细胞数增加，凋亡细胞的体积变小，胞核浓缩。葛根素和大豆甙元的诱导凋亡阳性细胞能力弱，原位检测不明显（图略）。
3讨论
葛根黄酮提取物的抗肿瘤功效最早是在1994年见到相关报道，但是葛根黄酮抗肿瘤的作用途径及分子信号途径没有得到揭示。本实验结果说明，葛根黄酮提取物通过诱导凋亡达到抗HL?60人白血病的功效。作为葛根主要成分的葛根素和大豆甙元，其诱导HL?60细胞凋亡的能力低于葛根黄酮提取物，其中大豆甙元的诱导凋亡能力强于葛根素。由于葛根黄酮提取物中含21％左右的三羟基异黄酮，而三羟基异黄酮是强诱导凋亡的黄酮类化合物[4]，推测葛根黄酮提取物的诱导凋亡能力强于葛根素和大豆甙元与其三羟基异黄酮组分有关。 细胞分化是近年来研究发现的。某些恶性肿瘤在体外可被某些物质诱导分化为具有与它原来生理功能完全相同或几乎相同的细胞，从而为肿瘤的、研究开辟了新的方向[5]。但值得注意的是分化后的细胞不可能恢复其全部而只能恢复其部分正常功能。大豆甙元可以诱导HL?60向粒细胞分化，并呈浓度依赖性，分化成熟的HL?60细胞具有NBT还原力、非特异性脂酶染色能力及与单克隆抗体反应的能力[6]。在诱导分化中，细胞周期通常是阻滞于G0/G1期[7，8]。本实验中流式细胞仪周期分析揭示葛根素和大豆甙元阻滞HL?60细胞周期于G0/G1期，与NBT还原力实验相符。大豆甙元和葛根素诱导HL?60细胞分化的能力高于葛根黄酮提取物，可能是葛根黄酮提取物中各种黄酮类化合物的相互影响而导致的。本实验说明葛根黄酮提取物通过诱导HL?60细胞凋亡发挥抗肿瘤功效，而其单体黄酮—葛根素和大豆甙元是通过诱导HL?60细胞分化而发挥作用，葛根素的抗肿瘤效果最差。三羟基异黄酮可能在葛根黄酮提取物诱导HL?60细胞凋亡中发挥主效作用。后续研究需进一步揭示葛根黄酮提取物诱导HL?60细胞凋亡的可能分子机制。
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