人肺癌细胞株化疗敏感性与基因表达的关系

           作者：宋现让，魏玲，王兴武，刘贤锡

【摘要】  　　目的 探讨人肺癌细胞株对化疗药物的敏感性与多药耐药相关基因和凋亡调控基因表达的关系。方法 采用MTT法检测5株肺癌细胞SPCA1、NCI?H446、 SH?77、95C和95D对阿霉素（ADM）、顺铂(DDP)、丝裂霉素（MMC）、5?氟尿嘧啶（5?Fu）、卡氮芥（BCNU）的敏感性。流式细胞术检测多药耐药基因P?糖蛋白（P?gp）、谷胱甘肽?S?转移酶?π（GST?π）、肺耐药蛋白（LRP）、多药耐药相关蛋白（MRP）和甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）等耐药相关基因和Fas 、bcl?2、p53和p16等凋亡调控基因的表达。结果 不同肺癌细胞株对同一药物敏感性有较大差异。相关分析显示，肺癌细胞株对MMC的敏感性与GST?π和bcl?2的表达呈负相关，P值分别为0.040和0.030，GST?π和bcl?2的表达水平较高者，MMC的IC50较高，敏感性较低；对DDP的敏感性与p53蛋白表达水平呈负相关(P=0.036)；对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关（P>0.05）。结论 人肺癌细胞株对不同化疗药物敏感与否有不同的机制，对MMC的敏感性与GST?π和bcl?2的表达有关，对DDP的敏感性与p53的表达有关。

【关键词】  肺癌细胞株　流式细胞术　化疗敏感性　多药耐药相关基因　凋亡调控基因

　　The  Chemotherapy  Sensitivity and  Gene  Expression in Lung  Cancer Cell Lines

　　Abstract：Objective   To explore the relationship of chemotherapy sensitivity and expression of multidrug resistance genes and apoptosis regulation genes in human lung cancer cell lines.Methods  MTT method was used to detect the sensitivity on adriamycin(ADM),cisplatinum(DDP), mitomycin C(MMC), fluorouracilum(5?Fu),carmustine(BCNU) in five lung cancer cell lines including SPCA1、NCI?H446、 SH?77、95C and 95D. Multidrug resistance genes including P?glycoprotein(P?gp), Glutsthione?s?transferases?π (GST?π), Lung resistance protein (LRP), Multidrug resistance related protein (MRP)，MGMT and apoptosis regulation genes Fas,bcl?2,p53 and p16 were examined by flow cytometry(FCM) .Results  The chemotherapy sensitivity was obviously divergent in different lung cancer cell lines. The correlation analysis revealed that there were negative correlations between the sensitivity on MMC in lung cancer cell lines and the expression of  GST?π  or bcl?2, the P value were 0.040 or 0.030 respectively. The cell line with higher expression of  GST?π or  bcl?2 had higher  IC50 of  MMC, the sensitivity on drug were poor; the sensitivity on DDP in cell lines had negative correlations with the expression of p53 protein, the P value was 0.036. There were no correlations among the sensitivity on other drugs and expression of other genes（P>0.05）.Conclusions  The mechanism about the sensitivity on divergent drugs was different in human lung cancer cell lines.The sensitivity on MMC had correlation with the expression of GST?π  and bcl?2, The sensitivity on DDP related to the expression of  p53.

　　Key words：Lung cancer cell line; Flow cytometry; Chemotherapy sensitivity; Multidrug resistance genes; Apoptosis regulation genes

　　0  引言
   
　　肺癌目前的发病率和死亡率均居我国城市男性肿瘤的首位，约75%的肺癌患者确诊时已属中晚期，化疗是其主要手段，耐药性是影响化疗效果的主要因素。近年来，随着肿瘤分子生物学和对基因功能的深入研究，人们逐渐认识到暴露于化疗制剂后决定肿瘤细胞命运的主要是基因型而非制剂的基因毒性，肿瘤细胞相关基因的表达水平是造成对同一化疗药物敏感性不同的主要原因[1]。为深入探讨肺癌化疗耐药机制，我们以体外培养的5株人肺癌细胞为研究对象，研究其对常用化疗药物的敏感性与耐药相关基因和细胞周期及凋亡调控相关基因表达的相关性，以期为临床用药提供指导。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞株
   
　　人肺腺癌细胞株SPCA1、人小细胞肺癌细胞株NCI?H446和SH?77，低和高转移肺巨细胞癌细胞株95C和95D均购自中科院上海细胞生物学研究所。细胞在含10%FBS(Hyclone)的DMEM(Gibco)培养液（含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中于37℃、5% CO2培养，2～3天传代一次。

　　1.2  药物敏感性实验
   
　　用MTT比色法检测肺癌细胞对阿霉素（ADM）、5?氟尿嘧啶(5?Fu)、顺铂(DDP)、丝裂霉素C (MMC) 和卡氮芥（BCNU）的敏感性。调细胞密度为1×105/ml，每孔100μl加入96孔板，每种药物设5个浓度倍比稀释等级，每浓度3个复孔。依据报道血浆峰值药物浓度（PPC）[2]和预实验结果确定ADM、5?Fu、DDP、MMC 和BCNU的基准实验浓度（BTC）分别为0.4μg/ml、20.0μg/ml、2.0μg/ml、2.0μg/ml和8.0μg/ml，5个倍比稀释浓度分别为1/4、1/2、1、2、4倍BTC。37℃、5% CO2孵箱中培养48h后加MTT (Sigma,5mg/ml) 每孔10μl，继续培养4h，加10%SDS?HCl每孔100μl，24h后用Bio?rad 450型酶标仪测各孔吸光度（A），检测波长为570nm、波长为630nm。按下式各浓度条件下细胞存活率(VR)。VR(%)=实验孔A值/对照孔A值×100%。Microsoft Excel 软件作图计算50％抑制浓度（IC50）。

　　1.3  基因表达的流式细胞术(FCM)检测
   
　　细胞悬液用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤2次（1000r/min,5min）后调至1×106/ml。对P?gp和Fas，取100μl细胞悬液直接加入PE 标记的鼠抗人P?gp单抗或FITC标记的鼠抗人Fas单抗及各自同型对照（B?D Pharmogen）20μl，室温避光反应30min即可检测。余基因蛋白表达的样品需用70％乙醇4℃固定24h或先用1%多聚甲醛室温固定5min，经1% BSA的PBS洗涤（1000rpm,5min）2次后加1∶10通透液2（B?D Pharmogen）500μl，室温作用10min后用PBS洗涤并调浓度为1×106/ml。凋亡调控基因p53、p16、bcl?2的免疫荧光染色为一步法，100μl细胞悬液直接加入FITC标记的鼠抗人p53、p16、bcl?2 单抗及各自同型对照（B?D Pharmogen）20μl，室温避光反应30min待检；余耐药基因染色为二步法，100μl细胞悬液先加一抗10μl，其中GST?π（250μg/ml，1∶10）和LRP（250μg/ml，1∶10）为B?D Pharmogen产品，MRP（0.5mg/ml，1∶20）和MGMT（1mg/ml，1∶40）为Chemicon产品。室温避光反应30min后加二抗FITC?IgG1（B?D Pharmogen，1∶10）5μl，30min室温避光反应后检测。流式细胞仪为FACS Calibur型（B?D）。蛋白表达以相对荧光强度（RFI）表示。RFI=加单抗管细胞荧光强度/同型对照管细胞荧光强度。

　　1.4  统计学分析
   
　　数据用SPSS(10.0)软件处理。数据以±s表示，相关性采用Pearson相关性分析。

　　2  结果

　　2.1  人肺癌细胞株的化疗敏感性
   
　　细胞株对5种化疗药物的敏感性见图1，其IC50值见表1。

　　2.2  细胞株化疗敏感性与基因表达的关系
   
　　各细胞株耐药相关蛋白和凋亡调控蛋白表达分别见图2、图3。Pearson相关分析显示，肺癌细胞株对MMC的敏感性与GST?π和bcl?2的表达呈负相关(P＜0.05)，GST?π和bcl?2表达水平较高者，MMC的IC50较高，敏感性较低；对DDP的敏感性与p53蛋白表达水平呈负相关(P＜0.05)；对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平均无关（P＞0.05），见表2。

　　ABCDEA：ADM,  B：DDP,   C:5-Fu,  D： MMC,   E：BCNU

　　图1  细胞株对各化疗药物的敏感性（略）

　　表1  肺癌细胞株对化疗药物的敏感性（略）

　　表2  肺癌细胞株对化疗药物的敏感性与蛋白表达的相关性 （略）
　　
　　3  讨论
   
　　化疗是肺癌综合治疗的重要措施之一，但不同患者对相同化疗方案的治疗效果和反应有差别，特别是不同病理类型的肺癌之间对化疗药物的敏感性差异较大，这一点在本研究中也得到证实，5株人肺癌细胞对同一药物的IC50值最多可以相差35倍。因此，为避免治疗的盲目性，有必要探索细胞对化疗敏感或耐药的更深层的原因，为肿瘤的个体化疗提供依据。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的，人们逐步认识到基因表达水平不但决定肿瘤发生、发展和预后，而且与化疗敏感性存在某种相关性，为此我们选择5个不同类型的人肺癌细胞株作为对象，排除细胞类型的因素，研究其对5种临床常用化疗药物的敏感性与耐药相关基因、细胞周期及凋亡调控基因的蛋白表达水平之间的相关性。结果表明，肺癌细胞株对MMC的敏感性与GST?π和bcl?2表达水平相关具有显著性(P＜0.05)，对DDP的敏感性与p53蛋白水平相关具有显著性(P＜0.05)，均呈负相关关系。

   
　　报道，肺癌耐药性与多种耐药基因的表达有关，其中某些基因的表达可能是化疗药物诱导的结果，是继发耐药的原因，如P?gp蛋白，在未暴露于化疗药物的肿瘤细胞表达水平较低。本文的研究结果表明，肺癌细胞的原发耐药性与P?gp、LRP、MRP和MGMT的表达水平相关不显著。谷胱甘肽?S?转移酶（GST）是一组具有多种生理功能的蛋白质超基因家族，它能催化GSH与亲电性物质结合，而许多抗肿瘤药物如烷化剂、蒽环类、铂类化合物等均具亲电性，因此其表达增加能保护细胞免受抗癌药物的攻击而产生耐药。目前认为，与肿瘤多药耐药关系最密切的是GST?π。临床研究发现GST?π表达阳性肿瘤化疗敏感性较差，如在非小细胞肺癌患者组织中GST?π表达与含DDP化疗方案的疗效显示负相关[3]。本研究显示Gst?π表达与MMC敏感性呈负相关性（P<0.05），与ADM、DDP敏感性虽也呈负相关但无统计学意义，这与Suzuki 和Xu等的结果一致[4,5]。

　　图2  肺癌细胞株耐药相关蛋白表达（略）

　　图3  肺癌细胞株凋亡调控蛋白表达（略）
   
　　许多化疗药物具有细胞周期特异性，p53突变使肿瘤细胞的周期调控机制受到影响，同时化疗药物通过p53在DNA损伤和修复过程中的诱导凋亡机制增加细胞毒性。因此，一般认为突变p53蛋白与DNA损伤抗癌剂的效果呈负相关。Lowe等[6]和Li等[7]证明wtp53可提高DDP、鬼臼乙叉甙（VP?16）、5?Fu和放射线的细胞毒性，wtp53转染耐药人肝癌细胞Bel7402/5?Fu可显著增加细胞对5?Fu、VcR和ADM的敏感性。本文结果也证实了这一点，在5株肺癌细胞中，p53突变蛋白的表达水平与DDP的敏感性相关。
   
　　肿瘤细胞的凋亡是一个复杂的过程，受凋亡促进和凋亡抑制基因的调控。bcl?2基因为凋亡抑制基因，可通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤发生、过程。bcl?2高表达可以抑制细胞的凋亡，增加肿瘤细胞对抗癌剂的抗拒。Kim等[8]和Tanabe等[9]用bcl?2反义寡核苷酸分别处理甲状腺癌细胞系8305C和乳腺癌细胞系MDA?MB?231 and BT?474时发现细胞对MMC的敏感性提高，本研究结果与之相似。
   
　　从本文结果看出，肺癌细胞对化疗药物的敏感性，不同的药物有不同的相关因素，除本文检测的9种基因外，已报道的化疗敏感性相关的基因或蛋白还有TS、二氢叶酸还原酶（DHFR）、金属硫蛋白（MT）、TopoII、Her?2/neu等。随着对肿瘤分子生物学和基因功能的不断深入研究，必将有一些敏感性和特异性高的表达基因用于预测肿瘤化疗疗效，更好地指导临床化疗。

【文献】
  　　［1］ Matsuhashi N, Saio M, Matsuo A, et al.p53 dependence and apoptosis in response to FP treatment with p53?transfected colon cancer cell lines by use of thin layer collagen gel[J]. Oncol Rep,2004,12(2):357?361.

　　[2] 刘叙仪.人新鲜癌组织药敏试验及其方法［A］.韩锐. 肿瘤的化学预防及药物[M]. 第1版.北京: 北京医科大学协和医科大学联合出版社出版, 1994. 417?419.

　　[3] Arai T, Yasuda Y, Takaya T, et al. Immunohistochemical expression of glutathione transferase?pi in untreated primary non?small?cell lung cancer[J]. Cancer Detect Prev,2000,24(3):252?257.

　　[4] Suzuki K, Yamamoto W, Park JS,et al. Regulatory network of mitomycin C action in human colon cancer cells[J].Jpn J Cancer Res,1999 ,90(5):571?577.

　　[5] Xu BH, Gupta V, Singh SV. Mitomycin C sensitivity in human bladder cancer cells: possible role of glutathione and glutathione transferase in resistance[J].Arch Biochem Biophys,1994,308(1):164?170.

　　[6] Lowe SW, Ruley HE, Jacks T, et al. Housman DE. p53?dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents[J].Cell,1993,74(6):957?967.

　　[7] Li YX, Lin ZB, Tan HR. Wild type p53 increased chemosensitivity of drug?resistant human hepatocellular carcinoma Bel7402/5?FU cells[J].Acta Pharmacol Sin, 2004,25(1):76?82.

　　[8] Kim R, Tanabe K, Uchida Y, et al. Effect of bcl?2 antisense oligonucleotide on drug?sensitivity in association with apoptosis in undifferentiated thyroid carcinoma[J]. Int J Mol Med,2003,11(6):799?804.

　　[9] Tanabe K, Kim R, Inoue H, et al. Antisense bcl?2 and HER?2 oligonucleotide treatment of breast cancer cells enhances their sensitivity to anticancer drugs[J]. Int J Oncol,2003,22(4):875?881.