缺氧对骨肉瘤细胞系MG?63 HIF?1α、p53、bcl?2及细胞凋亡的影响
作者：蔡文涛 陈安民 郭风劲 管频
【摘要】 目的了解缺氧环境对骨肉瘤MG?63细胞缺氧诱导因子HIF?1α、p53、bcl?2的表达及细胞凋亡的影响。方法建立骨肉瘤细胞体外缺氧模型，观察不同缺氧时间段(8、16、24h)HIF?1α、p53、bcl?2的表达和细胞凋亡的情况。半定量RT?PCR方法检测HIF?1α、p53、bcl?2的表达水平；免疫组化(SP法)和免疫印迹(Western Blot)检测HIF?1α、p53、bcl?2蛋白表达情况；流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果缺氧处理后，HIF?1α转录水平未见明显改变，蛋白表达水平随缺氧时间延长明显增强；而p53、bcl?2 mRNA及蛋白表达水平均显著增强，两者间存在一定的相关性；细胞凋亡率却未见明显增加。结论在缺氧条件下，不能通过以HIF?1α为中介的p53依赖途径来诱导骨肉瘤MG?63细胞的凋亡，其机制可能与缺氧诱导野生型p53的突变或缺失使HIF?1α和bcl?2的过表达有关。
【关键词】 骨肉瘤；缺氧诱导因子?1α；p53；bcl?2；细胞凋亡
Effect of Hypoxia on the Expression of Hypoxia Inducible Factor 1α、p53、bcl?2 and Apoptosis in Osteosarcoma Cell Line MG?63
Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of hypoxia on the expression of ypoxia inducible factor 1α(HIF?1α)、p53、bcl?2 and apoptosis in osteosarcoma cell line MG?63 under hypoxia environment.Methods The hypoxia culture model was established by a hypoxia incubator.The gene productions of HIF?1α、p53、bcl?2 and the changes of the apoptosis were observed at different hypoxia culture phase.The semi?quantitative reverse transcriotion PCR(RT?PCR) was used to test the mRNA expression of HIF?1α、p53 and bcl?2.The protein level of HIF?1α、p53 and bcl?2 was observed by immunohistochemical staining and western blot analysis.The changes of apoptosis were analyzed using flow cytometry.ResultsAfter the hypoxia treatment,the mRNA level of HIF?1α was not changed significantly,however,the protein expression of HIF?1α was increased remarkably with correspondence to the hypoxia time.But the expression of p53 and bcl?2 were up?regulated in mRNA and protein level.Besides,the bcl?2 activity was markedly associated with the level of HIF?1α.However,the apoptosis rate was not increased markedly.ConclusionIn hypoxia environment,the apoptosis of osteosarcoma cell line MG?63 could not induce by the p53 avenue which depended on HIF?1α.The mechanism is possibly related with the mutation of p53 that increases the expression of HIF?1α and bcl?2.
Key words：Osteosarcoma;Hypoxia inducible factor?1α;p53;bcl?2;Apoptosis
0引言
缺氧是实体肿瘤组织内部普遍存在的现象。研究表明缺氧可以诱导HIF?1α正常表达的肿瘤细胞凋亡，而在HIF?1α表达缺失的肿瘤不可以，反而导致肿瘤恶性程度的增高和转移的加快[1]。说明缺氧诱导的肿瘤细胞凋亡是通过HIF?1α介导的。本实验研究缺氧条件下，骨肉瘤MG?63细胞 HIF?1α、p53、bcl?2的表达水平以及对细胞凋亡的影响，进一步了解肿瘤细胞逃避凋亡的机制，为开展针对HIF?1α介导的细胞凋亡途径的提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料骨肉瘤细胞株MG?63于武汉大学典型培养物保藏中心购得；新生牛血清、RPMI?1640培养基购于Gibcol公司；鼠抗人HIF?1α、p53、bcl?2单克隆抗体均购于San Cruze公司；AP碱磷酶标记抗小鼠IgG和过氧化物酶标记羊抗鼠IGg的二抗以及BCIP/NBT和二氨基联苯胺(DAB)显色液，购自北京中杉生物技术公司；RT?PCR试剂盒均购自晶美生物工程公司。95%N2和5%CO2缺氧培养箱(英国Galaxy公司生产，由同济呼吸科实验室提供)。
1.2方法
1.2.1细胞培养MG?63细胞于含10%小牛血清的RPMI?1640培养液中，在5%CO2、37℃培养箱中培养。以0.25%的胰酶消化、传代。实验细胞均取二、三代的对数期的细胞。
1.2.2分组取对数期细胞以(2～5)×105/孔接种至2ml培养液的6孔板中，于5%CO2、37℃培养箱中培养。待细胞长至90%以上时随即分为A组(常氧组)和B组(缺氧组)在不同的培养箱内继续培养，分不同时间段(8、16、24 h)对其进行相应处理,每组每个时间段设6个复孔。
1.2.3RT?PCRTizol法提取总RNA,用分光光度计进行定量和纯度检测。逆转录合成cDNA后进行PCR反应，引物见表1，琼脂糖电泳鉴定产物，照相后灰度值分析，以目的基因与内参照基因的比值作为mRNA的相对含量。
表1HIF?1α、p53、Bcl?2和β?actin引物（略）
1.2.4免疫印迹试验(Western Blot)裂解液提取细胞核蛋白，考马斯亮兰蛋白定量。十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，350V电转移30min将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭非特异结合位点，然后分别加入HIF?1α、p53、bcl?2一抗(1∶1000稀释)，37℃温育2h，再加入二抗(1∶5000)，37℃温育1h，DAB显色。照相后行图像定量分析。
1.2.5免疫组化(SP法)制1×1细胞爬片，待细胞长至70%～80%时，加入相应的干预。95%的冷丙酮固定10分钟，然后按照SP试剂盒说明进行染色。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：随机观察6个高倍镜(10×20)下肿瘤细胞染色阳性的细胞个数，平均阳性细胞率。
1.2.6凋亡细胞检测(Sub?G1法)胰酶消化后，取2×105细胞，70%的乙醇固定，4℃保存过夜。PBS漂洗，溴化丙啶染色后，FAC Sort流式细胞仪(美国BD公司)检测。
1.3统计学方法SPSS12.0软件进行数据分析，采用t检验和Spearman′s检验。
2结果
2.1缺氧处理后HIF?1α、p53和bcl?2 mRNA转录的变化缺氧各个时间段的结果显示，见图1，MG?63细胞系中HIF?1α mRNA常氧条件下存在较高转录，随着缺氧时间延长，mRNA的转录没有明显改变(P>0.05)；而p53、bcl?2 mRNA的转录在缺氧培养后显著升高。与对照组相比，缺氧8、16、24小时后 p53 mRNA的转录分别提高了3.43倍、5.22倍和7.15倍(P<0.01)，bcl?2 mRNA活性也分别提高了4.25倍、6.64倍和7.56倍(P<0.01)。同时，统计学分析发现缺氧组各时间段之间p53、bcl?2 mRNA的转录也存在显著性差异(P<0.05)。
图1mRNA的表达(RT?PCR) （略）
2.2缺氧对HIF?1α、p53和bcl?2蛋白表达的影响免疫组化显示(图2～4)，常氧下，HIF?1α蛋白表达阴性；缺氧后，可见强表达的HIF?1α蛋白棕黄色颗粒，主要定位于细胞核，阳性细胞率随缺氧时间的延长阳性细胞率逐渐增加。p53阳性反应产物呈棕褐色颗粒状，主要定位于细胞核，部分可见于胞浆。常氧组p53为弱阳性表达，其阳性细胞率为(21±2)%；缺氧处理后，p53蛋白表达水平明显增强(P<0.05)，各时间段的阳性细胞率分别为(43±2)%、(61±2)%、(75±2)%。bcl?2阳性产物主要定位于胞浆，常氧下未见明显表达；缺氧处理后，bcl?2蛋白表达明显提高(P<0.05)，阳性细胞率分别为(34±2)%、(46±2)%、(63±2)%。
图6细胞凋亡率(Sub?G1法) （略）
Western Blot分析表明，见表2,图5：HIF?1α在常氧组未见表达，缺氧处理组在分子量120×103(120kD)处均可见高表达的HIF?1α蛋白印迹，其中缺氧24小时组表达最高。而p53蛋白水平与常氧组比较，缺氧各时段分别提高了2倍、2.8倍和3.5倍。bcl?2表达水平缺氧组较常氧组显著升高(P<0.05)。并且在缺氧组，三者的蛋白表达水平随缺氧时间的延长而明显增加(P<0.05)。
图5蛋白的表达(Western Blot) （略）
以往实验证实，p53蛋白表达在一定程度上可以反映p53基因的点突变[2]。本试验各组p53蛋白水平和相应HIF?1α、bcl?2的表达水平相比较，发现HIF?1α、bcl?2的表达水平与突变型p53蛋白的量明显相关，相关系数分别为0.963、0.975 (P=0.001)。
表2蛋白表达 Western Blot （略）
2.3各组细胞凋亡情况流式细胞仪检测结果显示，见表3,图6：常氧组细胞凋亡较少；缺氧处理后，细胞凋亡率未见明显增加，与常氧组比较，其差异无统计学意义(P>0.05)。
表3细胞凋亡率（略）
3讨论
恶性肿瘤的发生和是细胞无限增殖所致，增殖过快必然导致肿瘤局部组织缺氧和供能与耗能之间的不平衡。缺氧时，肿瘤局部新生血管的形成和糖酵解的增加等提高供氧供能机制在促进肿瘤生长中的作用已被实验证实。近年来人们发现缺氧时细胞凋亡的抑制在肿瘤的发生及发展中可能有一定的作用。细胞凋亡和增殖与细胞周期有关的基因密切相关。低氧诱导的与细胞周期有关的基因大致可以分为两类：一类是HIF?1α依赖性的，如p53、p21、bcl?2等；另一类是非HIF?1α依赖性的，如p27、GADD153等[3]。其中HIF?1α与p53的关系在肿瘤的演进中有特别重要的地位。HIF?1α是氧调节亚基，实验证实它对维持肿瘤细胞的能量代谢、促进肿瘤增殖和转移起重要作用[4]。同时许多研究发现，HIF?1α也能调节细胞的凋亡。Carmelliet[3]等证明，缺氧时HIF?1α与野生型p53结合可以稳定p53，并通过Mdm2稳定上调p53水平，从而介导肿瘤细胞通过p53依赖途径发生凋亡[6]。而p53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。缺氧是p53最强的生理性诱导剂。研究证实，缺氧情况下野生型p53也参加了对HIF?1α的调节。一方面通过与p300竞争结合HIF?1α的CAD抑制HIF?1α介导的转录；另一方面促进MDM2介导HIF?1α泛素化和蛋白酶性降解[7]，从而减弱HIF?1α在细胞缺氧反应调节过程中作用。然而在恶性肿瘤中存在着大量的基因突变，其中p53基因的改变是最常见的现象，包括p53基因缺失或基因重排、点突变所致的失活等。研究发现，突变型p53丧失了对HIF?1α表达的抑制功能，在p53缺失或突变的肿瘤细胞内，HIF?1α明显积聚[8]。本研究结果支持这一观点。缺氧组，HIF?1α的蛋白表达水平明显增强，突变型p53蛋白表达强度也显著高于常氧组，同时HIF?1α的表达与突变型p53蛋白表达之间呈显著正相关。结果提示，在骨肉瘤MG63细胞体外缺氧模型中，野生型p53发生了缺失或突变，从而使HIF?1α水平提高，进一步加强了肿瘤细胞对缺氧的适应性调节。bcl?2基因，即B细胞淋巴瘤/白血病基因?2，是一种抑制细胞凋亡的基因。它通过阻断细胞凋亡的信号传递通路达到抑制或阻断凋亡过程[10]。肿瘤中bcl?2的过度表达已得到证实[11]。研究发现，野生型p53可以通过下调bcl?2基因介导细胞的凋亡[11]；而突变型p53却在mRNA及蛋白水平上调bcl?2的表达[12]。本试验结果显示，缺氧条件下，bcl?2的mRNA及蛋白水平明显升高，细胞凋亡未见明显增加，而bcl?2的表达与突变型p53蛋白水平显著相关。这说明缺氧作为一种生理性的选择，可以通过诱导和选择突变型p53，从而上调bcl?2的表达，抑制凋亡的发生。综上所述，在骨肉瘤MG63细胞体外缺氧模型中，缺氧并不能通过以HIF?1α为中介的p53依赖途径来诱导肿瘤细胞的凋亡。其机制可能是缺氧诱导了野生型p53发生突变或缺失，一方面使HIF?1α表达增加，提高肿瘤能量代谢和血管生成；另一方面使bcl?2过表达，抑制了细胞的凋亡。而且缺氧通过对突变型p53的选择，使肿瘤向更恶性的表型发展，更易于发生转移。
【】
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