CYP2C9、GST M1基因多态性与肺癌易感性的关系

             作者：王启明，卢桥发，甄海宁，鲍敏，张焕景

【摘要】  　　目的 探讨细胞色素P450 2C9（CYP2C9）基因、谷胱甘肽硫转移酶M1(GST M1)基因多态性与肺癌易感性的关系。方法 用PCR?RFLP法分析56例肺癌（简称肺癌组）和42例健康对照组NsiⅠ识别的CYP2C9基因型；用PCR法分析其GST M1基因型。结果 突变型CYP2C9*3型基因发生频率在肺癌组中为8.93%，高于对照组的4.76%，其差异无显著性(P>0.05)。肺癌组GST M1基因缺失型〔GST M1（-）〕发生率为71.43%，高于对照组的45.24%，其差异有显著性(P<0.01); GST M1（-）型与肺癌呈高度联系强度，OR=3.09（95%CI=1.32～6.94）；GST（-）基因型在吸烟的肺癌组（81.08%）与对照组（52.18%）之间的频率差异有显著性（P<0.05）。结论 突变型CYP2C9*3型基因与肺癌无显著性联系；GST M1（-）基因型是肺癌发生的遗传易患性因素; 吸烟可显著提高GST（-）基因型个体患肺癌的危险性。

【关键词】  CYP2C9基因　GSTM1基因 　基因多态性　肿瘤易感性；肺肿瘤

　　Relationship between  CYP2C9 and GST M1 Genetic Polymorphism and  Lung Cancer Susceptibility

　　Abstract：Objective   To evaluate the relationship between  CYP2C9 ， GST M1 genetic polymorlism and   susceptibility  of  lung cancer.Methods  The polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphlism (PCR?RFLP) was used to detect CYP2C9 genotype in 56 lung cancer cases and 42 controls. The PCR was also used to detect GST M1 genotype in the two groups.Results  The frequencies of mutation genotype of CYP2C9*3 was not significant difference between lung cancer cases and controls.However, in the lung cancer cases, the frequency of GST M1(-)(71.43%) was significantly higher than that in controls(45.24%), P<0.01，and the odd ratio(OR) was  3.09(95%CI=0.63-10.33).The GST M1(-) genotype was  significantly more common among patients with smoking (81.08%)when compared to the controls with smoking too(52.18%,P<0.05).Conclusions  There was no association between  the mutation genotype of CYP2C9*3 and lung cancer, while GST M1(-) was the  susceptible factor for the development of lung cancer.And smoking might elevate the risk  of  lung cancer for the individuals with GST M1(-) genotype.

　　Key words：CYP2C9; GST M1; Neoplastic susceptibility; Genetic polymorlism; Lung cancer

　　0  引言
   
　　大量动物实验和流行病学研究表明,大气污染、吸烟、职业接触致癌物是肺癌的主要致病因素,其中最主要的化学致癌物为多环芳烃(polycyclic aromatic carbons, PAHs)。化学致癌物经过Ⅰ相酶代谢，如细胞色素P450(CYP)酶体系活化成他们的终形式。这些终形式又经过Ⅱ相酶，如谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）的作用成为亲水性的物质而失去活性。可见，肺癌的发生可能取决于Ⅰ相酶和Ⅱ相酶在机体内的平衡。GSTM1酶是Ⅱ相酶的重要成员，其空白基因型（GST M1(-)基因型）与多种肿瘤的易感性有关［1］。为此，我们对56例肺癌患者及42例正常对照组的CYP2C9和GST M1的基因多态性进行了检测，观察两种基因多态性的分布状况，以探讨肺癌的遗传易感性因素。

　　1  资料和方法

　　1.1  研究对象  选择具有细胞学和/或病诊断的肺癌56例为暴露组（简称肺癌组），其年龄64.86±12.53岁，工龄31.93±8.17年，男性50例，女性6例； 选择同一地区健康体检者42例为对照, 年龄59.12±12.51岁，工龄28.54±12.10年，男性38例，女性4例。调查对象抽取静脉血3ml，EDTA抗凝。

　　1.2  检测方法

　　1.2.1  CYP2C9*3型基因的检测(PCR?RFLP法)  P1选择人CYP2C9 基因DNA序列第7外显子的第151bp～182bp位的 32个碱基设计, 序列为cag  atg  ctg  tgg  tgc  acg  agg  tcc  aga  gat  gc; P2选择第296bp～320bp位的25个碱基设计, 序列为aat  gat  act  atg  aat  ttg  gga  ctt  c。扩增长度为170bp。检测CYP2C9*3型基因PCR反应总体积50μl，97℃ 预变性10min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，最后72℃延伸7min。CYP2C9*3型基因PCR产物纯化后取5μg加入限制性内切酶NsiⅠ1μl，37℃消化3h； 3.0%琼脂糖中电泳(70V，1h)后，在图象分析仪内观察，记录并拍照。野生型CYP2C9*3基因经过NsiⅠ酶切后产生140bp和30bp两个基因片段，突变型则不能被切开，见图1。
   
　　1道：100bp DNA-ladder；3道：突变型CYP2C9*3基因；2、4、5、6、7、8、9道：野生型CYP2C9*3基因

　　图1  CYP2C9*3型基因酶切电泳图谱（略）

　　1.2.2  GST M1基因检测(PCR法)  在GST M1基因第6、7外显子上设计一对引物(P3，P4)。P3序列为gaa  ctc  cct  gaa  aag  cta  aag  c; P4序列为gtt  ggg  ctc  aaa  tat  acg  gtg  g。扩增长度为215bp。 扩增GST M1基因PCR反应总体积50μl， 97℃ 预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，最后72℃延伸5 min。在1.8%琼脂糖中电泳(70V,1h)后，在图象分析仪内观察，记录并拍照GST M1扩增产物,见图2。

　　1道：100bp DNA?ladder；2、5道:GST M1基因携带；3、4、6、7、8、9道：GST M1基因缺失

　　图2  GST M1基因扩增产物电泳图谱（略）
　　
　　1.3  数据处理和分析  用SAS（6.12）软件建立数据库，对计数资料进行χ2检验。

　　2  结果

　　2.1  CYP2C9*3型基因分析
   
　　肺癌组突变型CYP2C9*3型基因检出率（8.93%），高于对照组检出率（4.76%），差异无显著性意义（P＞0.05），见表1。
   
　　肺癌组GST M1（-）型基因检出率（71.43%）高于对照组（45.24%），差异有显著性意义（P<0.01）; GST M1（-）型与肺癌呈高度联系强度（OR=3.03，95% CI为1.32～6.94），见表2。表1  肺癌组、对照组突变型CYP2CP*3型基因检出率比较（略）表2  肺癌组、对照组GST（-）型比较（略）

　　2.2  GST M1基因型分析

　　2.2.1  肺癌组、对照组GST M1基因缺陷型〔GST（-）〕比较

　　2.2.2  肺癌组、对照组吸烟状况和GST M1基因型不同的比较
   
　　肺癌吸烟患者GST M1（-）型基因发生率显著高于对照组吸烟人群， P<0.05，吸烟可使GST（-）基因型个体患肺癌的危险性升高3.97倍（95%CI=1.24～12.64)；组内分析表明，肺癌组内吸烟与非吸烟之间GST M1（-）型基因发生率之间的差异亦有显著性， P<0.05，见表3。表3  吸烟与不吸烟肺癌患者与对照组GST（-）型率的比较（略）*   χ2=5.31,  P<0.05；χ2=0.99,  P>0.05;*肺癌与对照组内吸烟与非吸烟GST M1携带与缺失率比较
　　
　　3  讨论
   
　　CYP2C9是人类肝脏中含量丰富的一种CYP450酶，它能代谢和/或活化许多种药物、前致癌物、前毒物和致突变剂［2］。CYP2C9基因具有遗传多态性［3］。国内研究表明，CYP2C9在药物代谢中具有重要的作用，表现在临床方面可导致药效增强或降低［2］，也可引起毒副作用发生；而CYP2C9与肺癌遗传易感性的关系国外有相关报道,国内未见报道。Yilmaz等［4］利用PCR?RFLP方法研究肺癌患者CYP2C9基因与血浆中CEA、α?FP、IL?6、IL?8的关系，结果CYP2C9*1基因在Gaziantez种族中占64%，并认为不同类型CYP2C9基因中肿瘤标志物和细胞因子的差别可能与致癌物的暴露水平和等位基因的不同表达有关。本次对56例肺癌患者及42例对照组的CYP2C9*3基因型调查表明，肺癌组突变型CYP2C9*3型基因检出率为8.93%，高于对照组的检出率（4.76%），差异无显著性意义（ P>0.05）。CYP2C9基因第7外显子上NsiⅠ位点呈现多态性（Ile359Leu），如果亮氨酸（Leu）替代异亮氨酸（Ile），则改变酶结构，从而降低酶的催化能力［5］，降低了CYP2C9酶对化学致癌物的代谢能力，可能与肺癌发生有关，这有待扩大样本进一步研究。
   
　　Ketter 1992年首次报道，GST M1（-）型与肺癌的敏感性有关后，国内外对此进行了大量研究，结果颇不一致。Micwilliam等［6］分析提示，GST M1（-）型中度增加肺癌危险性。本次以56例肺癌为观察对象，并以条件相当的42例健康体检者为对照，结果肺癌组GST M1（-）型检出率为71.43%，而对照组检出率为45.24%，差异有显著性意义，Ｐ<0.01；GST M1（-）型与肺癌呈高度联系强度（OR=3.03，95%CI为1.32～6.94）。由此类推，GST M1（-）型可能使肺癌易感性增高，而GST M1（+）型对环境致癌物的暴露有保护作用。
   
　　张友才等［7］研究表明，重度吸烟可增加GSTM1（-）型基因个体胃贲门癌的危险度（OR=3.38，95%CI=1.21～9.42）。本次研究表明，肺癌组吸烟患者GST M1（-）型基因发生率显著高于对照组吸烟人群，Ｐ<0.05，OR=3.97（95%CI=1.24～12.64）；组内分析表明，肺癌组内吸烟与非吸烟之间GSTM1（-）型基因发生率的差异有显著性，Ｐ<0.05。香烟含有几十种致癌物,其中PAHs、亚硝酸盐的致癌性已被广泛认识。一些经Ⅰ相代谢酶活化的前致癌物是GST M1的底物，如香烟中的多环芳香胺（PHA），4、5?环氧化苯并a芘（BaPo）等，GST M1在代谢失活这些致癌物过程中起重要作用。 GST M1基因缺失型 (空白基因) 产生大量无活性的酶,导致机体解毒能力下降［8］, 这可能是吸烟导致GST M1（-）基因型人群中肺癌超出的原因。因此，GST M1（-）基因型者应加强防范环境致癌物暴露，同时大力倡导戒烟对肺癌的发生有重要的意义。

【】
  　　［1］ Sgambato A,Campisi B,Zupa A,et al. GSTpolymorphism as risk factor for cancer in highly homogeneous population from sothern Italy[J].Anti cancer Res,2002,22(15):3647?3652.

　　[2] 卢爱华,舒焱,周宏灏.细胞色素氧化酶CYP2C9的研究进展[J].临床药杂志,2000,16(5):67?69.

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　　[4] Yilmaz N, Erbagci AB, Aynacioglu AS. Cytochrome P4502C9 genotype in Southeast Anatolia and possible relation with some serum tumour markers and cytokines[J]. Acta Biochim Pol 2001, 48(3):775?782.
　　
　　[5] Takanashi K, Tainaka H,Yasumori, et al.CYP2C9 Ile 359 and Leu variants:enzyme kinetic study with seven substrates[J]. Pharmacogenetics，2000,10（1）:95?104.

　　[6] Micwilliam JE, Sanderson BJ,Harris EL,et al. the Glutathione S?transferase M1(GST M1)deficiency and lung cancer risk[J]. Cancer Epidem for Biomarkers Prev, 1995,4（5）:589?594.

　　[7] 张友才,邓长生,朱尤庆. GSTM1基因多态性和吸烟与喷门癌易感性关系研究[J].肿瘤防治研究,2004,31(7):441?443.

　　[8] 胡毅玲,高杨,张桥. 细胞色素P450 1A1、2D6 谷胱甘肽转移酶基因多态性与肺癌易感性的研究[J].肿瘤,1998,18(4):269?271.