HPV16 E7和Brn?3a在宫颈癌前病变中的表达及其意义

【摘要】  目的 研究HPV16 E7和Brn?3a在各级宫颈癌前病变（CIN）中的表达情况以及两者之间的关系，从分子生物学水平探讨其作为宫颈癌前病变的特异性标志物的可能性，以期寻找新的宫颈癌前病变筛查方法。方法 对71例患者行宫颈薄层细胞学检查（Thinprep Cell Test，TCT），并在阴道镜下组织学活检，其TCT残留标本，用RT?PCR法检测各标本中HPV16 E7和Brn?3a的表达。结果 HPV16 E7和Brn?3a表达按细胞学分级和病分级其阳性率呈逐级增高趋势，差异均有显著性（P<0.0001）。两者作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的诊断标志物，其结果是一致的（P＜0.05）。结论 TCT残留标本适合进行RT?PCR分析研究。HPV16 E7可作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的生物标志物。Brn?3a可作为可靠的CIN3生物标志物和HPV致癌基因转录活化的标志物。HPV16 E7和Brn?3a相互作用，可能为宫颈高度癌变的原因之一。

【关键词】  宫颈癌前病变;TCT;HPV16 E7;Brn?3a;RT?PCR

    Significance of HPV16 E7 and Brn?3a Expression in Cervical Neoplasia

      Key words：Cervical neoplasia; TCT; HPV16 E7; Brn?3a; RT?PCR

    宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，居女性肿瘤死亡原因的第三位。据统计 [1]，每年有大约3.7万人发病，发病率以每年2%～3%的速度增长，与近年来宫颈癌的早期检出率增高及发病年轻化有关。在发达国家，宫颈癌的发病率已明显下降，这在很大程度上归功于对癌前病变的早期诊断和。因为从宫颈癌前病变发展成宫颈癌，有一个较长的过程，大约需5～10年，在此期间加强宫颈防癌检查，尽早发现异常症状，采取有效的治疗方案，可积极防止宫颈癌前病变发展为癌。本实验利用新柏氏薄层液基细胞涂片检查（ThinPrep cell test,TCT）的残留标本，进行RT?PCR检测，测定标本中16型人乳头瘤病毒致癌蛋白E7（HPV16 E7）和细胞转录因子Brn?3a的mRNA表达情况，从分子学水平探讨宫颈癌前病变中高危型人乳头瘤病毒（HR?HPV）致癌基因活化情况，以及Brn?3a和HPV16 E7作为宫颈上皮内癌变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）的生物标志物的特异性。

    1资料和方法

    1.1临床资料

    选取2004年8月～2004年11月在重庆医科大学附属第一行宫颈TCT检查的71位患者，年龄21～63岁，平均36.8岁，所有患者在取样前均未接受任何妇科相关疾病的治疗，用宫颈刷刷取宫颈细胞并洗入TCT保存液中备用。

    1.2方法

    1.2.1收集细胞标本

    用RNase的离心管吸取1ml TCT残留标本底层沉积物，离心后弃上清，沉淀用PBS液洗2次，离心后去上清，-20℃保存备用。

    1.2.2RT?PCR法（检测HPV16 E7及Brn?3a mRNA的表达）

    TCT残留标本的总RNA提取参照Trizol试剂盒操作程序进行。逆转录采用TaKaRa公司的AMVRT酶，方法按说明书进行。HPV16 E7基因引物设计参照[2]。上游引物：5′? AGCTCAGAGGAGGAGGATGA?3′ ，下游引物：5′?GGTTTCTGAGAACAGATGGG?3′，预计扩增片段长度为203bp；Brn?3a基因引物设计参照文献[3]，上游引物：5′?GTCGACATGGACTCGGACACG?3′，下游引物：5′?AGCCCCCTCAGTAAGTGGCA?3′；内对照β?actin基因引物设计参照文献[4]，上游引物：5′?ACACCTTCTACAATGAGCTG?3′，下游引物：5′?CTGCTTGCTGATCCACATCT?3′，扩增片段长度为828bp。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s，共30个循环；72℃再延伸，10min。取PCR产物5μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳（80V，40mA，60min）。紫光灯下观察摄像。

    1.3统计学分析

    分析细胞学分级和病理学分级，各组HPV16 E7和Brn?3a的mRNA的阳性表达情况，比较两者在宫颈表达中的关系，并进行χ2检验。

    2结果

    2.1细胞学和病理学诊断结果  见表1。表171例患者的细胞学及病理学诊断

    2.2RT?PCR检测结果

    2.2.1HPV16 E7 mRNA的表达情况

    TCT残留标本中，HPV16 E7 mRNA的表达阳性率在细胞学诊断和病理学诊断中，随病变严重程度，呈逐级上升趋势，见图1。在细胞学诊断中，未见癌变细胞者（within normal limit,WNL）的HPV16 E7阳性表达率为7.69%（1/13），不典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cells,ASC）为29.41%（5/17），低度鳞状上皮内病变（low grade squamous intraepithelial lesion,LSIL）为31.58%（6/19），高度鳞状上皮内病变（high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL）为59.09%（13/22），统计分析差异有显著性意义（P<0.01）。在病理学诊断中，炎症组的阳性表达率为0%（0/21），CIN1组为31.58%（6/19），CIN2组为60%（6/10），CIN3组为61.90（13/21），统计分析差异有显著性意义（P<0.0001）。

    2.2.2Brn?3a mRNA的表达

    Brn?3a mRNA的表达阳性率在细胞学和病理学诊断中，均随病变严重程度呈上升趋势，见图2。在细胞学诊断中，WNL组的阳性率为7.69%（1/13），ASC组为23.53%（4/17），LSIL组为21.05%（4/19），HSIL组为72.73%（16/22），统计分析差异有显著性意义（P<0.001）。在病理学诊断中，炎症组阳性率为0%（0/21），CIN1组为5.26%（1/19），CIN2组为50%（5/10），CIN3组为90.48%（19/21），统计分析差异有显著性意义（P<0.0001）。

    3讨论

    宫颈癌是一种感染性疾病，已得到共识，其病因主要是人乳头瘤病毒感染。其中HR?HPV感染是宫颈癌及癌前病变发生的主要始动因素,国外已开始利用HR?HPV DNA进行宫颈癌筛查。HR?HPV为维持自身的生存和复制，能合成一系列蛋白质，包括自身结构蛋白（衣壳蛋白）和致癌蛋白（E2、E6、E7等转录因子）。这些致癌蛋白干扰正常细胞的调控，导致组织细胞异常增生、遗传变异和转化，从而病毒的持续存在引发宫颈上皮瘤变，最终引起癌变。最常见的HR?HPV是HPV16型，HPV16包括八个病毒基因编码区编码六个非结构蛋白、两个结构蛋白和三个非结构蛋白，E5、E6、E7因其在体外实验中能诱导细胞转化而被称为致癌蛋白，且E6、E7蛋白能在体内诱导肿瘤的发生[5]，E6、E7基因是HPV最主要的导致细胞永生化的病毒癌基因，E6、E7的持续表达是引起和维持宫颈癌瘤变细胞所必须的。检测HR?HPV16型的E7蛋白可直接反映HPV的复制和转录的活化状态，可作为另一个宫颈癌变的生物标志物。

    Brn?3a是一个POU（Pit?Oct?Unc and Unc?85 cellular transcription）家族的细胞转录因子，又称转录因子1、Brn?3.0、POU4F1，其（POU4F1）基因定位于13q21.1?q22[6]。POU是三种哺乳动物转录因子的首写字母：Pit?1、Oct?1和Oct?2以及Unc?86[7]。它们是最早发现的具有高度保守的DNA结构区域即POU结构区域的转录因子。POU家族转录因子能结合八聚体DNA成分。其保守序列主要包括POU特殊区域的一个N端和等同区域的一个C端，中间为一段可变的氨基酸。Brn?3a主要分布于神经系统和宫颈上皮细胞中。Vishwanie等[8]研究显示Brn?3a是一种有抗凋亡作用的因子， Brn?3a可减弱促凋亡因子p53的活性。人为减少宫颈细胞中Brn?3a的表达水平将大大减少HPV基因的表达、生长率和形成肿瘤的能力，显示Brn?3a在宫颈转化过程中发挥着关键性作用[9]。Ndisang等[3]认为在人类宫颈细胞中，Brn?3a有激活HPV E6和E7癌基因转录的作用，并发现CIN3的女性活检组织中Brn?3a的表达水平增高。

    本研究利用TCT残留标本对HPV16 E7和Brn?3a的mRNA进行RT?PCR检测，并与所取样本的细胞学和病诊断结果进行比较分析，研究其作为宫颈癌前病变的生物标志物的可行性。细胞学诊断各级的HPV16 E7的阳性率，随病变级别升高而增加，HSIL明显高于WNL，良性反应性改变组、ASC和LSIL虽有逐级增高的趋势，但无统计学意义。其良性反应性改变组HPV16 E7有1例为阳性表达，病理学诊断为CIN3、ASC中阳性表达共有5例，其中2例为CIN1，1例CIN2，2例CIN3；LSIL中阳性表达有6例，其中4例为CIN1，1例CIN2，1例CIN3。由此可见，HPV16 E7在鉴别LSIL、ASC和良性反应性改变中隐藏的CIN病变方面有一定作用。各级病理学诊断的HPV16 E7的阳性率，随病变严重程度增加而增加。HPV16 E7在炎症组中无阳性表达，各级CIN的阳性率均高于炎症组，虽有逐级增高趋势，但无统计差异。在高度宫颈癌变中，HPV16 E7的阳性率仅为61.90%，主要考虑受HPV16在CIN3中感染率的影响。因此，HPV16 E7可作为宫颈上皮内癌变的生物标志物，并可说明病变的HPV活化状态。

    Brn?3a的RT?PCR检测发现WNL中有1例阳性表达，病理学诊断为CIN3，ASC中有4例阳性，其中1例为CIN2，3例为CIN3；LSIL中有4例阳性，1例为CIN1，2例CIN2，1例CIN3。可见，Brn?3a有助于检测出低度病变以及不典型病变中隐藏的CIN病变，尤其是CIN2和CIN3。各级病理学诊断组中Brn?3a的阳性表达主要集中于CIN2和CIN3，其阳性率高于CIN1组，而炎症组无阳性表达，显示Brn?3a参与宫颈癌变的过程，与Ndisang等[3]的研究结果一致，可作为一个可靠的宫颈上皮内癌变和HPV致癌基因转录活化的生物标志物。

    分析HPV16 E7和Brn?3a的表达关系发现，两者的表达有较高的一致性，结果中发现HPV16 E7为阳性而Brn?3a为阴性者共有8例，其中5例为CIN1，CIN2 2例，CIN3 1例，考虑Brn?3a在CIN1和CIN2中表达较低，此例CIN3无法解释；Brn?3a为阳性而HPV16 E7为阴性者共有8例，其中7例为CIN3，1例为CIN2，考虑宫颈癌前病变中除HPV16型感染外，还存在其他类型HR?HPV感染。因此，同时结合HPV16 E7和Brn?3a有助于提高对宫颈癌前病变的筛查。

    本实验均取采样7天内的TCT残留标本（标本中RNA降解少）进行总RNA提取。少量TCT残留细胞即可达到提取RNA的目的，实验效果佳。TCT标本是进行RNA分析的良好平台，便于我们开展对宫颈疾病的分子生物学研究。此外，TCT一次性取材后，其残留标本被妥善保留，便于进行多种分子生物标志物检查。TCT与HPV16 E7和Brn?3a等宫颈癌前病变的生物标志物的研究相结合，将为临床细胞学筛查提供一个有效的辅助方法，可探测低度病变和不典型病变中隐藏的CIN3，减少宫颈癌筛查系统的漏诊率，还为评估HPV的感染状态提供直接和间接的生物学标志物，对临床和随访有着重要的指导性意义。

【】
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