FHIT在结直肠癌中的表达及其与Caspase?3、 PCNA之间的关系

             作者：李铭，袁宏银，陈中安，邓文龙，廖红，刘铭球

【摘要】  目的 探讨FHIT蛋白﹑Caspase?3及PCNA在散发性结直肠癌（sporadic colorectal carcinoma, SCC）组织中的表达及其临床意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测92例SCC组织和28例正常结直肠组织中FHIT蛋白、Caspase?3和PCNA的表达。结果 （1）FHIT蛋白、Caspase?3、PCNA在正常结直肠组织及SCC组织中的阳性表达均有显著性差异（P<0.01）。（2）FHIT蛋白、PCNA表达与SCC组织学分级、Duke’s分期、淋巴结转移、5年生存率相关（P<0.01）。（3）Caspase?3的表达同SCC组织学分级、5年生存率相关（P<0.05）。（4）SCC组织中FHIT蛋白和Caspase?3两者表达呈明显正相关；FHIT蛋白和PCNA表达呈明显负相关（P<0.01）。（5）FHIT蛋白和Caspase?3，FHIT蛋白和PCNA联合表达与SCC的组织学分级、Duke’s分期、淋巴结转移及5年生存率均有关（P<0.05）。结论 （1）FHIT蛋白、PCNA的表达与SCC的发生﹑恶性程度及预后有关；（2）Caspase?3的表达与SCC的发生﹑预后有关；（3）联合检测FHIT蛋白、Caspase?3及FHIT蛋白、PCNA可以用于筛查SCC的高危人群。

【关键词】  结直肠癌；FHIT蛋白；免疫组织化学；预后

       Key words：Colorectal carcinoma；FHIT protein；Immunohistochemistry；Prognosis

    本研究采用免疫组织化学SP法检测92例散发性结直肠癌（sporadic colorectal carcinoma,SCC）和28例正常结直肠组织中FHIT蛋白、Caspase?3和PCNA的表达，探寻三者的异常表达与SCC发生﹑恶性程度及预后的关系，以发现早期诊断和预测预后的可靠指标。

    1  资料与方法

    1.1  病例资料

    收集武汉市商业职工及武汉大学中南医院1997年1月～2004年1月手术切除的SCC患者石蜡标本92例，其中男性49例，女性43例，年龄31～73岁（中位年龄52岁），以上患者均经病理确诊，并收集距离癌病灶5～10cm正常结直肠组织28例。选取材料经HE染色。本组资料只收集了SCC的腺癌及粘液腺癌，腺癌按其组织分化的程度分为高、中、低分化，本研究将粘液腺癌归为低分化型。其中高分化癌27例、中分化癌39例、低分化癌26例；按Duke’s分期：A期26例、B期41例、C期25例。此外，92例SCC患者中，对2000年6月前的42例进行了5年随访，5年内死亡15例，5年生存率为64.3%。

    1.2  免疫组化试剂

    兔抗人FHIT多克隆抗体，鼠抗人Caspase?3单克隆抗体，鼠抗人PCNA单克隆抗体，均为即用型，购于北京中山生物技术有限公司；广谱型SP试剂盒、DAB显色剂，购自福州迈新生物工程公司。

    1.3  方法

    免疫组化采用SP法。一抗为兔抗人FHIT多克隆抗体、鼠抗人Caspase?3单克隆抗体和鼠抗人PCNA单克隆抗体。生物素标记二抗，DAB显色，苏木素复染，以PBS替代一抗作阴性对照，以已知阳性片作阳性对照。具体步骤按试剂盒说明书进行操作。

    1.4  免疫组织化学结果判断

    根据Hao等［1］以染色强度和染色范围来界定FHIT蛋白、Caspase?3的表达，见图1、2，染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性（+），<2分为阴性（-）。根据Garcia等［2］的标准评估PCNA表达情况，见图3，阳性细胞表达>26%为阳性，其他为阴性。

    1.5  统计学方法

    采用卡方检验、Fisher精确概率法和Spearman相关分析

    2  结果

    2.1  正常结直肠组织及SCC组织中FHIT蛋白、Caspase?3、PCNA的表达与临床指标的关系，见表1。

    2.2  FHIT蛋白与Caspase?3和PCNA表达的相关性  92例SCC组织中，FHIT蛋白与Caspase?3、PCNA表达相一致分别为64.1%（59/92）、25.0%（23/92），见表2。

    2.3  FHIT蛋白、Caspase?3联合表达与SCC组织分级、Duke’s分期、淋巴结转移和5年生存率的关系  FHIT蛋白、Caspase?3联合表达在92例SCC组织中的具体情况见表3。统计学分析发现FHIT蛋白、Caspase?3联合表达与SCC的组织学分级（χ2＝14.4918，P＝0.0138）、Duke’s分期（χ2＝19.2255，P＝0.0038）、淋巴结转移（χ2＝12.6340，P＝0.0015）和5年生存率（χ2＝12.9892，P＝0.0025）均有关。

    2.4  FHIT蛋白、PCNA联合表达与SCC组织分级、Duke’s分期、淋巴结转移和5年生存率的关系

    FHIT蛋白、PCNA联合表达在92例SCC组织中的具体情况见表4。统计学分析发现FHIT蛋白、PCNA联合表达与SCC的组织学分级（χ2＝17.1352，P＝0.0027）、Duke’s分期（χ2＝34.8397，P<0.0001）、淋巴结转移（χ2＝12.0144，P＝0.0025）和5年生存率（χ2＝8.2000，P＝0.0247）均有关。表1  正常结直肠组织及散发性结直肠癌组织中FHIT蛋白、Caspase?3、PCNA的表达与临床指标的关系表2  FHIT蛋白在SCC中的表达及其与Caspase?3和PCNA的相关性

    3  讨论

    有研究发现，FHIT基因异常转录和FHIT蛋白表达缺失参与SCC的发生。Hao等［1］研究发现正常的结肠上皮组织FHIT蛋白强表达，FHIT蛋白低表达有随分化程度的降低和远处转移而增加的趋势。但Luceri等［3］应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription?polymerase chain reaction，RT?PCR）技术检测56例SCC患者FHIT基因的表达，发现FHIT基因异常转录与SCC的临床病理特征无关。究其原因，Corce等［4］认为FHIT基因功能改变主要与其蛋白的表达量相关，而似乎与基因的结构改变无关，因其突变的蛋白仍有抑癌作用，故认为应用免疫组化方法检测FHIT蛋白原位表达比用RT?PCR技术检测FHIT基因异常转录与肿瘤临床病理特征的关系的准确性和实用性更高。本研究结果发现SCC组织中FHIT蛋白阳性率显著低于正常结直肠组织；在92例SCC中，分化程度越低、Duke’s分期越晚和有淋巴结转移的癌组织，FHIT蛋白低表达越明显；在42例随访病例中，5年死亡组中FHIT蛋白表达率低于5年存活组；从而说明，FHIT蛋白低表达参与SCC的发生和发展，FHIT蛋白低表达随着肿瘤分化程度的降低和远处转移有增加趋势，并反映SCC的预后差。表3  FHIT蛋白、Caspase?3在SCC中的表达情况表4  FHIT蛋白、PCNA在SCC中的表达情况近年来发现Caspase?3参与了肿瘤发生过程中细胞凋亡异常的病理过程［5，6］。本组研究表明，Caspase?3的阳性表达率在SCC组织中显著低于正常结直肠组织，因此推测Caspase?3参与了正常结直肠粘膜上皮的发育及转化细胞凋亡过程的调节，Caspase?3失表达促进了肿瘤细胞的生长，在SCC的发生中可能起了重要的作用。我们还发现Caspase?3在高、中、低分化SCC中的阳性率逐渐降低，三者间比较差异有显著性，Caspase?3在5年生存组中的阳性表达率明显高于5年死亡组，表明Caspase?3与SCC分级和预后有关；SCC的Caspase?3表达阳性，可能提示癌细胞分化程度高，细胞凋亡调控机制障碍程度轻，癌细胞增殖较弱，患者预后较好。但Caspase?3同SCC的分期和淋巴结转移无关，说明Caspase?3也许是通过某种途径促进高增殖性的肿瘤细胞凋亡，但是其并没有参与组织间质的破坏和肿瘤细胞的粘附。

    PCNA是细胞合成期必不可少的因子。本实验发现SCC组织中PCNA的阳性率显著高于正常结直肠组织，也证明了PCNA反映癌组织高增殖的性能。本研究还表明在92例SCC中，分化程度越低、Duke’s分期越晚和有淋巴结转移的癌组织中，PCNA高表达越明显。在42例随访病例中，5年死亡组PCNA阳性表达率明显高于5年存活组。提示PCNA的高表达与SCC肿瘤细胞的增殖能力、淋巴结转移能力相一致，且预后越差。

    国外学者研究发现用FHITcDNA封闭FHIT后，细胞中Caspase?3活性降低，并且细胞的凋亡水平下降，说明FHIT可以使Caspase?3表达上调，进而促进细胞发生凋亡。因此检测FHIT蛋白和Caspase?3可能可以作为判断结直肠癌发生、发展及预后的指标，目前两者联合检测尚未见报道。本研究显示，在92例SCC组织中FHIT蛋白和Caspase?3表达呈显著正相关，FHIT蛋白、Caspase?3联合表达与SCC的组织学分级、Duke’s分期、淋巴结转移和5年生存率均有关。这与单独检测Caspase?3与Duck’s分期、淋巴结转移无关相悖，但鉴于92例SCC中FHIT蛋白、Caspase?3表达一致率为64.1%，说明两者有较大的互补性，当做联合检测时，可以提高诊断SCC的特异性和阳性预测值，从而提高诊断的准确性，并且可以判断SCC的恶性程度及预后。

    Sard等［7］利用Tunel及流式细胞仪研究对转染FHIT的H460阳性细胞克隆发现，细胞周期俘获于G0/G1期，说明FHIT可能通过细胞周期俘获而抑制肿瘤的增殖。在本研究结果中，92例SCC组织中FHIT蛋白和PCNA表达呈显著的负相关，FHIT蛋白、PCNA联合表达与SCC的组织学分级、Duke’s分期、淋巴结转移和5年生存率均有关，说明FHIT蛋白在SCC组织中表达的升高可能使细胞周期停滞于G0/G1期，PCNA的含量随细胞合成停止无法达到峰值，进一步提示FHIT对肿瘤增值活性的抑制作用。联合检测FHIT、PCNA可以判断SCC的恶性程度及预后。

【】
  ［1］ Hao XP,Willis JE, Pretlow TG, et al. Loss of fragile histidine triad expression in colorectal carcinomas and premalignant lesions［J］.Cancer Res,2000,60(1):18?21.

［2］ Garcia RL,Coltrera MD,Gown AM. Analysis of proliferation grade using anti? PCNA/cyclin monoclonal antibodies in fixed, embedded tissues: Comparison with flow cytometric analysis［J］. Am J Pathol, 1989, 134(4): 733?739.

［3］ Luceri C, Guglielmi F, De Filippo C, et al. Clinicopathologic features and FHIT gene expression in sporadic colorectal adenocarcinomas［J］. Scand J Gastroenterol, 2000, 35(6): 637?641.

［4］ Croce CM, Sozzi G, Huebner K.Role of FHIT in human cancer［J］. J Clin Oncol, 1999, 17(5): 1618?1624.

［5］ Pizem J, Cor A, Zadravec Zaletel L, et al. Prognostic significance of apoptosis in medulloblastoma［J］. Neurosci Lett,2005, 381（1?2）: 69?73.

［6］ Matsumoto Y, Iwamoto Y, Matsushita T, et al. Novel mechanism of hybrid liposomes?induced apoptosis in human tumor cells［J］. Int J Cancer, 2005, 115(3): 377?382.

［7］ Sard L, Accornero P, Tornielli S, et al. The tumor?suppressor gene FHIT is involved in the regulation of apoptosis and in cell cycle control［J］. Proc Natl Acad Sci UAS, 1999, 96 (15): 8489?8492.