人CC10基因在肺腺癌A549细胞中的表达
【关键词】 CC10基因
Expression of Human CC10 Gene in Lung Adenocarcinoma A549 Cell
Abstract：Objective To construct and identity human the expression plasmid pcDNA3.1?hCC10. Methods A 273 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of normal lung tissue by RT?PCR,then inserted it into expression vector pcDNA3.1 by DNA recombinant techniques . We transfected pcDNA3.1? hCC10 in A549 cells by liposome?mediated gene transfer method. The protein expression of CC10 was detected by the techniques of immunofluorescence and Western blot. Results After the identification of restriction enzymes analysis and sequencing,the recombinant plasmidpcDNA3.1?hCC10 was confirmed which contained the correct and entire nucleotide sequence of the CC10 DNA in pcDNA3.1. The expression of CC10 in protein level ascend in A549 cells transfected with reconstructive plasmid. Conclusion The pcDNA3.1?hCC10 expression plasmid was successfully constructed, acquired stably protein expression in A549 lung cancer cell line.
Key words：CC10;Gene cloning;Gene expression
摘要：目的 构建及鉴定人CC10基因真核细胞表达载体。方法 采用RT?PCR法，从人肺组织的总RNA中扩增出273bp的人CC10 cDNA片段，利用DNA重组技术将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，脂质体法转染pcDNA3.1?hCC10到肺腺癌A549细胞，荧光免疫细胞化学法及Western blot法检测CC10蛋白的表达。结果 用酶切重组质粒并行序列鉴定，人CC10基因已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，体外染pcDNA3.1?hCC10的肺腺癌A549细胞中CC10蛋白表达明显增高。结论 成功构建了CC10基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1?hCC10，并获得表达。
关键词：CC10;基因克隆;基因表达
0 引言
CC10是肺clara细胞主要分泌蛋白。过去研究表明CC10与哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）等多种肺部炎性疾病的发生、有关[1]。近年来，CC10作为一种新型抑癌基因引起学者们广泛关注[2]。本实验构建CC10基因的真核表达载体，为下一步阐明CC10的抑癌机制提供有益的帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
肺腺癌A549细胞及大肠杆菌DH5α由本实验室保存。CC10多克隆抗体购于美国Biovendor公司，PGEM?T.PCR产物回收试剂盒及Lipofection分别为promega、Takara及Invitrogen等公司产品，pcDNA3.1质粒由华中科技大学同济医学院生化实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 取同济医科大学附属同济胸外科手术病人剥离的肺组织100g并剪碎，按RNA抽提试剂盒提取总RNA。
1.2.2 人CC10的cDNA合成 以提取的总RNA为模板，加入随机引物oligo(dt)15(0.5mg/ml)、dNTP(10mmoL/L)各1μl, DEPC处理的无菌去离子水7μl，70℃变性10min，随后在M?MLV逆转录酶的作用下完成cDNA第一链的合成。以新合成的cDNA为模板，加入上游引物：5’?TACACAGTGAGCTTTGGGC?3’及下游引物：5’?ATGAAACTCGCTGTCACCC?3’，在PE480扩增仪上扩增，扩增参数为：94℃45s,55℃1min,72℃1min,循环35次， PCR产物用1.5%琼脂糖电泳。
1.2.3 人重组真核表达质粒pcDNA3.1?hCC10的构建 将PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1分别用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，琼脂糖电泳后回收、纯化后连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α。在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，随机挑取单个菌落，摇菌培养，小提取试剂盒提取质粒DNA进行初筛。重组真核表达质粒pcDNA3.1?hCC10的构建。
1.2.4 CC10 DNA序列测定 用双酶切法分解扩增后的阳性重组质粒pcDNA?CC10，回收目的基因DNA，采用Sang双脱氧法行序列测定（上海博亚公司）。
1.2.5 基因转染 A549肺腺癌细胞株接种于6孔培养板，在RPMI 1640培养基（含10%FCS），37℃，5%CO2的条件下行常规培养，细胞培养至70%，按试剂盒的步骤行脂质体转染，并设空质粒对照组及空白对照组。
1.2.6 细胞免疫荧光观察CC10蛋白质表达 转染48h后，将转染的A549细胞爬片分别用40g/L多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次。依次加入50μl 1∶200 CC10一抗、二抗及1∶100鼠抗人IgGFc?FITC荧光抗体100μl，制片后立即于倒置荧光显微镜摄像。
1.2.8 Western blot法检测CC10蛋白质表达 待各实验组中A549细胞生长至106个，加入适量预冷的三去污细胞裂解液，按常规的方法行细胞总蛋白提取，用紫外分光光度计测量蛋白浓度。上样每孔加入10～15μl样品胶后，10mA恒流下的丙烯酰胺凝胶电泳4h，其中浓缩胶及分离胶的浓度分别为4%、10%。电泳结束后行转膜及免疫杂交DAB显色反应。
2 结果
2.1 人CC10 DNA的制备
RT?PCR扩增后所获得的人CC10电泳产物位于 Markers的250bp附近，见图1，与预期的273bp目的片段大小接近，表明扩增片段是我们所需的目的基因片段。
2.2 人CC10真核表达质粒的酶切鉴定
用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切对真核表达载体pcDNA3.1?hCC10鉴定结果表明，获得预期大小(273bp)的DNA片段及5.4kbp大小的pcDNA3.1片段，见图2。
2.3 序列测定结果
电泳回收的PCR产物经小提试剂盒抽提，纯化后用酶切分析方法对PCR产物进行测序。DNA序列分析证明与已报道的基因序列一致，其序列为：
atgaaactcg ctgtcaccct caccctggtc acactggctc tctgctgcag ctccgcttct gcagagatct gcccgagctt tcagcgtgtc atcgaaaccc tcctcatgga cacaccctcc agttatgagg ctgccatgga acttttcagc cctgatcaag acatgaggga ggcaggggct cagctgaaga agctggtgga caccctcccc caaaagccca gagaaagcat cattaagctc atggaaaaaa tagcccaaag ctcactgtgt aat
2.4 转染真核表达质粒后A549细胞CC10蛋白的表达
免疫荧光染色可观察到在未行转染的A549细胞浆中有少量的阳性物质表达，胞核则未见绿色荧光，见图3a；而转染hCC10基因的A549细胞浆中绿色荧光阳性物质表达明显增加，部分胞核亦可见绿色荧光。结果表明CC10蛋白在胞浆及胞核均有表达，其中以胞浆为主，见图3b。
Western blot显示A、B、C组泳道膜上深浅不一的黄色蛋白条带，见图4，与标准分子量对照，相对分子质量为16KD，其中A组泳道可见棕黄色条带，蛋白表达为强白表达呈强阳性；B、C组泳道均为淡黄色条带，蛋白表达为弱阳性，A组蛋白表达明显增强；A、B、C道分别为转染PCDNA3.1?hCC10组, 转染PCDNA3.1及空白对照组，
1?2 为RT?PCR product1.PcDNA3?hCC10 digested by BamH Ⅰ;
2. pcDNA3?hCC10 digested by HindⅢ and BamH Ⅰ;3. DNA mark
图1 RT?PCR产物hCC10DNA（略）
图2 pcDNA3?hCC10限制酶酶切鉴定（略）
图4 Western blot 检测A549细胞CC10蛋白表达（略）
3 讨论
Clara细胞是肺远端呼吸性细支气管上皮不含纤毛的一类内分泌细胞，归属于分泌性球蛋白（SCGB）家族，具有活跃的分泌及增殖分化等生物特性，其胞浆内含有丰富的分泌颗粒，能分泌多种蛋白质：clara分泌蛋白（CC10）、肺泡表面活性物质（SPs）、内皮素（ET）、磷脂酶，对维持正常肺功能及支气管结构的完整性具有十分重要的作用[3]。
CC10蛋白分子量约为16KD，由位于反间平行的70个氨基酸的同型二聚体组成，其含量约占肺泡灌洗液（BACF）的7%，是Clara细胞的主要分泌蛋白。而编码CC10蛋白的基因全长4.1kb,含有3个外显子及2个内含子，该基因在正常的生物进化过程中保持高度同源性，不易发生突变和缺失[4]。
CC10基因位定位于11q11?q13， 11 q上发生基因的重组与突变与人类的多种肿瘤密切相关[5]，过去研究表明CC10基因表达的下调与前列腺癌、宫颈癌及乳腺癌的发生、有关[6,7] 近年来发现CC10基因表达的下调可能与肺癌亦密切相关。人类90％的肺癌与吸烟密切相关，CC10基因表达与吸烟密切相关,吸烟的人群中腺上皮Clara细胞数及CC10的蛋白、mRNA的表达都明显下降[8]，Shijubo等[4]校正年龄、性别后发现CC10蛋白的降低与吸烟的剂量呈显著的线性相关性，吸烟每增加10包/年，血清中CC10蛋白降低15％。
尽管在正常肺组织中有大量的CC10基因表达，但在肺癌组织中CC10基因表达明显减少。本实验中我们应用免疫细胞化学及western blot等方法观察到A549细胞株中CC10蛋白表达明显减少或缺失。国外的研究与我们的结果相似，Shijubo等 [9]应用免疫组化等方法检测肺癌组织及癌旁组织中CC10的蛋白质表达明显减少；Szabo等[10]用Northern blot 方法观察到在非小细胞肺癌NSCLC中CC10 mRNA的表达率仅为20％。
另有学者研究表明CC10基因表达减少或缺失较肺癌形成较早，他们认为CC10的降低不是肿瘤形成后被动引发的，可能是肺癌的促发因素。
Yang等[11]在实验中观察到将香烟中足够剂量的强烈致癌剂NNK给予金仓鼠2～24周，按实验设计的要求在相应时间段处死实验对象并对鼠肺部CC10含量及成瘤状况进行观察，结果表明2周后肺部CC10即有下降，而6周后金仓鼠的肺部才观察到肺癌的形成。因而CC10基因表达的减少可能是肺癌的早期事件。
根据GeneBank中人CC10基因序列设计一对引物。分别引入HindⅢ和BamHⅠ双酶切位点，可扩增包括目的基因外显子的全部基因序列，使目的基因正确插入载体，经酶切及序列分析证实重组质粒构建正确、无缺失、插入及移码等实变，通过免疫细胞化学及western blot等方法证实，体外转染的A549细胞株CC10蛋白即能稳定的表达。
本实验构建的重组质粒为下一步研究CC10基因抑制肺癌形成机制及对肺癌的基因提供帮助。
（本文图3a、b见封3）（略）
【】
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