胃癌腹膜高转移潜能细胞系的建立及其生物学特性

【摘要】  目的 利用人胃癌细胞系（GC9811）在裸小鼠体内反复接种建立一株具有腹膜高转移潜能的胃癌细胞系(GC9811?P)，并对其生物学特性进行观察，为实验研究提供模型。 方法 采用胃癌细胞系(GC9811)在裸小鼠腹腔内反复接种，行体外培养腹膜转移灶筛选高转移亚系，绘制细胞生长曲线，光镜、电镜下观察细胞形态，利用流式细胞仪、染色体分析等方法，研究该高转移亚系的细胞周期、增殖、染色体核型等生物学特性。结果 母本细胞系GC9811腹膜转移形成率为33.3%(3/10)，而GC9811?P腹膜转移形成率为100%。两种细胞系腹膜结节组织学形态大体相似。增殖速度较母系加快。细胞周期分析G1 期53.5%、G2期12.5%、S期37.1%。且遗传学特性包括染色体形态仍为人类核型，众数维持在104～126之间，占70%。结论 具有腹膜高转移的胃癌细胞系GC9811?P的建立及裸小鼠体内实验模型，为研究胃癌腹膜转移机制及探索新的途径提供了极为有用的工具。

【关键词】  胃癌 腹膜转移 细胞系

　　0  引言
   
　　为研究胃癌浸润与转移机制及探索阻断其浸润与转移策略，本研究采用胃癌细胞系GC9811细胞悬液于腹腔接种，经体外培养腹膜转移结节，成功地建立了胃癌腹膜高转移细胞系GC9811?P，并对其生物特性进行了初步鉴定。

　　1  材料和方法

　　1.1  细胞系和细胞培养  GC9811人胃癌细胞系由西京全军消化病研究所提供，细胞置20%小牛血清的RPMI?1640培养液中于CO2恒温孵箱中培养，常规传代；BALB/C?NU/NU裸鼠，由生物药品鉴定所提供，鼠龄3～5周，体重15～20g，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，无菌食物和水由裸小鼠自由摄取。

　　1.2  方法

　　1.2.1  高转移亚系的筛选  用0.02%EDTA和0.125%的胰蛋白酶联合消化对数生长期的GC9811细胞，用无血清的RPMI?1640培养液洗涤3次，制备成1×107细胞悬液，接种于裸鼠腹腔，3周后，裸鼠出现全身衰竭，断颈处死，收集腹膜瘤结节行体外培养，获得的细胞系命名为GC9811?P1，于体外培养2～3代后，收集细胞再行裸鼠腹腔接种，用同样的方法重复4次，得到高转移细胞系GC9811?P4。采用有限稀释法，在96孔板中将GC9811?P4细胞稀释成每孔含0.5～1个细胞，次日在倒置显微镜下观察并挑选只含一个细胞的孔，待细胞增殖近面积1/3时，移至24孔板中扩大培养，得到胃癌腹膜高转移细胞株GC9811?P。

　　1.2.2  形态学检查  每只裸鼠均详细解剖，对肉眼未发现转移灶的肺脏进行连续切片，癌组织石蜡包埋、切片、HE染色，培养细胞用倒置显微镜观察，收集对数生长期的细胞，用30ml/L的戊二醛固定，树脂包埋，超薄切片并染色，以日立JEM?2000型透视电镜及扫描电镜观察细胞超微结构。

　　1.2.3  细胞增殖特性的研究  用MTT法测定细胞生长曲线。调整GC9811与GC9811?P细胞浓度,分别按1×103个细胞/孔接种于96孔板中，每孔加200μl培养液，置37℃、CO2孵箱中培养，每个样品重复3孔，每天用MTT比色法测定3孔中的A职（为490nm），绘制细胞生长曲线。流式细胞仪测定细胞周期及DNA含量：收集对数生长期的GC9811与GC9811?P细胞用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA溶液联合消化细胞，制备单细胞悬液，用PBS洗涤两遍，垂悬于5ml、4℃预冷的PBS中，95%的乙醇固定，调整细胞数为1×105/ml，经溴化乙锭染色后，在流式细胞仪上测定细胞周期及DNA含量。

　　1.2.4  体外侵袭实验  参照Albini等体外侵袭实验方法。Boyden(Biotech公司)小室上下室之间铺有直径为6.5mm的聚碳酸酯微孔滤膜（孔径为8μm），膜上均匀铺人工基底膜胶（matrigel）50μɡ/孔，下室加入NIH3T3细胞无血清条件培养上清200μl作为趋化因子，将小室置于37℃温箱中聚合30min。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，向上室中加入细胞悬液400μl，37℃，5%CO2孵箱中放置12h。弃上室液体，拭尽膜上未侵袭的细胞及人工基底膜胶，甲醇固定30min，常规HE染色。每个细胞同时做3个小室，200倍光镜下将膜以水平线及垂直线分为4个象限，在每个象限及膜中心取1个视野记数，取其均值。

　　1.2.5  染色体分析  取对数生长期的GC9811?P细胞，按[2]所述方法制片，镜检100个分散良好且完整的中期分裂相进行染色体分析。

　　1.2.6  双层琼脂试验  按常规方法检测克隆形成率。

　　1.2.7  支原体检测  采用透射电镜、地依红染色及肉汤培养法检测培养液及细胞内支原体。

　　1.2.8  体内成瘤性检测  将生长旺盛的GC9811与GC9811?P细胞制成0.2ml细胞悬液（含106～107个细胞）接种于12只3～4周龄的裸鼠背侧或腋下皮下，观察致瘤性，瘤结节每五天用卡钳测量肿瘤长径a和短径b并用公式W（瘤重）=（a×b2）/2肿瘤重量，绘制肿瘤生长曲线。

　　2  结果

　　2.1  腹腔移植模型的建立  将GC9811细胞系在裸鼠腹腔内种植，连续传代后，出现全身消瘦、呼吸困难和衰竭的时间平均为26天。GC9811?P6于腹腔接种19天后，大体解剖可见腹腔脏器广泛转移，腹膜可见多个直径约0.1～0.5mm大小不等的灰白色转移结节，伴有血性腹水形成（图略）。病理检查可见与母系腹膜转移结节组织学形态大体相似，见图1，实验过程中，所有动物出现全身衰竭后脱颈处死，双肺连续切片只见到大量炎细胞浸润。
 
　　2.2  异位移植环境对转移的影响  见表1。

　　表1  GC9811细胞悬液皮下、腹腔和胃浆膜下接种后生长与转移比较（略）

　　2.3  各代裸鼠腹腔接种的成功率及转移情况  见表 2。

　　表2  各代胃癌细胞系于裸鼠腹腔接种后的转移率（略）

　　2.4  腹膜转移克隆株的获得  GC9811?P6经体外传10代并去除成纤维细胞后，96孔板克隆化培养，获得4株克隆，其中一株生长力旺盛、增殖较快，裸鼠成瘤率高，潜伏期短。命名为胃癌腹膜高转移株GC9811?P。

　　2.5  细胞形态特点  GC9811与GC9811?P在相差显微镜下比较形态大致相似，活细胞以不规则、延伸出一到多个长短不等触角的上皮样细胞为主，有少量梭形细胞，生长的单层细胞有重叠生长能力。细胞核异型性明显，胞浆可见丰富的颗粒及空泡，见图2。扫描电镜观察，细胞表面有丰富的微绒毛。透视电镜示细胞核及核仁增大而有异形性，胞质较少，含有较多的线粒体，胞浆内有丰富的核糖体，可见核分裂相。

　　2.6  细胞增殖特性研究  取对数生长期GC9811与GC9811?P细胞绘制生长曲线，群体倍增时间分别为19.5h和18.6h。流式细胞仪分析细胞周期时相、增殖指数，见表3。并可见典型的非整倍体细胞峰，两种细胞DNA倍体类型未见明显差别。

　　表3  两种细胞系细胞周期的分布与增殖指数（略）

　　2.7  体外侵袭实验  GC9811和GC9811?P穿过人工基底膜的侵袭细胞数分别为(73±21）个和（103±16）个。t检验显示两者之间差异具有显著性（P<0.05）。

　　2.8  染色体分析  移植瘤连续传代后，染色体仍保持人肿瘤染色体的特点，分析第53代细胞100个中期分裂细胞的染色体，数目分布在58～126条之间，众数为104～126之间，占70%，主干系为五倍体，异常染色体出现频繁。

　　2.9  双层琼脂试验  第85代细胞双层琼脂培养12d，细胞克隆形成率约59%。

　　2.10  支原体检测  培养液及细胞内支原体均为阴性。

　　2.11  致瘤性与转移性  皮下接种的12只裸鼠一周左右均出现瘤结节，以后生长明显增快，30天后GC9811肿瘤重量较 GC9811?P明显增快，见图3。

　　图3  皮下肿瘤生长曲线（略）

　　3  讨论
   
　　在探究胃癌腹膜转移机制过程中，目前虽已建立了几种动物转移模型[1?4]， 但仍对其转移和侵袭的发生机制及其缺乏深入的认识。腹膜转移表现在它除一般的细胞增殖以外，还有肿瘤细胞的脱落、游离癌细胞粘附到腹膜着床、侵袭生长以及肿瘤周围血管的生成等多个病理步骤[5，6]。本模型采用人胃癌细胞悬液腹腔注入的方法，模拟了自由癌细胞脱落入腹腔后的过程。
   
　　临床中并非所有的腹腔游离癌细胞均可形成腹膜转移瘤,肿瘤转移中有众多的因子参与，彼此之间形成错综复杂的调控[7]。肿瘤异质学说认为：在同一肿瘤内，存在着转移性和侵袭性不完全相同的多种细胞亚群，当在一定的内外环境下促使某种细胞亚群变为占优势的肿瘤细胞亚群，转移便可发生。本实验在此理论基础上，癌细胞经腹腔连续传代，随着腹膜转移率增高的演进，得到一株腹膜高转移细胞株—GC9811?P。
   
　　人肿瘤细胞侵袭和转移一方面需具备合适的微环境，另一方面还须依赖肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与宿主之间的相互作用，肿瘤的侵袭和转移与肿瘤细胞所处微环境之间有着密切的关系，而且不同的组织微环境可能是肿瘤细胞生物学行为差别的主要因素[8]。本文结果可见，裸鼠皮下荷瘤较长时间（>60天）未见转移发生，主要因为皮下血供条件和淋巴引流较差。未见肺转移的原因可能为：瘤细胞本身不具备肺部转移的生物学特性；裸鼠体内免疫力有效遏制了转移；接种部位的微环境影响；荷瘤鼠未及转移就已死于恶病质。
   
　　GC9811?P与母本细胞系GC9811相比较，前者细胞增殖指数增加，腹腔接种潜伏期短、成瘤快，生长曲线属于无限细胞系曲线，细胞倍增时间较短。透视电镜示含有丰富的微绒毛、较多的线粒体，胞浆内有丰富的核糖体，可见核分裂相。流式细胞仪结果证明其DNA合成旺盛，恶性程度较高。染色体分析是确立细胞系的重要指标。GC9811?P染色体分析结果符合恶性细胞系的特点。
   
　　体内外实验结果证实，GC9811?P较母本细胞系的体外侵袭能力强，腹膜转移率高；而体外生长明显减慢，说明体外侵袭能力和体内转移能力可能是相关的表型，而生长与转移能力可能又是相独立的表型。
   
　　综上所述，GC9811?P细胞系，符合第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过的建系标准，是一株新建的胃癌腹膜高转移细胞株。
   
　　肿瘤细胞的体外培养建株难度大，成功率低。由于体外模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异，体外生存的细胞往往会发生某些生物学特性的改变或丢失。GC9811?P细胞系的建立及研究结果证明，该细胞系生物学特性稳定，未发生上述改变。为探究人胃癌腹膜转移机理及阻断其转移，提供了理想的细胞模型和裸鼠体内转移模型。

【】
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　　［2］Kaneko K. Yano M, Tsujinaka T, et al. Establishment of a visible peritoneal micrometastatic model from a gastric adenocarcinoma cell line by green fluorescent protein [J]. Int J Oncol, 2000, 16 (5): 893?898.

　　［3］白飞虎，郭新宁，杨力，等. 人胃癌裸鼠胃原位移植转移模型的建立［J］. 第四军医大学学报，2003，24(10): 873?875.

　　[4]Bai FH, Guo XN, Yang Li，et al. VEGF significance in peritoneal recurrence from gastric cancer[J]. Gastric Cancer, 2005, 8(3): 155?163.

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　　［7］周红艳，刁路明，陈莹，等. MMP?2、MMP?9和TIMP?1的表达与胃癌淋巴结转移及时间的关系 [J]. 肿瘤防治研究，2005，32（5）：274?275.

　　［8］李晓梅，耿敬姝，石清涛, 等. 同种异体移植瘤在不同组织微环境中生物学行为的差异及机制[J]. 肿瘤防治研究，2005，32（4）：226?227.