人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性
【关键词】 内皮抑素 腺病毒 基因 抗血管治疗 乳腺癌
0 引言
近年来，阻止肿瘤血管生成，控制肿瘤的生长和转移，成为肿瘤治疗的一项新策略［1，2］，其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成，以内皮抑素最为理想［3］。本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体，研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达，为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。
1 材料与方法
1.1 材料
携带人内皮抑素基因（human endostatin,hE）的质粒pBlast?hEndostatin购于美国InvitroGen公司；腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于Microbix Biosystems公司；人乳腺癌细胞株MBD?231和MCF?7、人脐静脉内皮细胞株ECV?304购于美国ATCC细胞库；LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司；各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司；QIAprep spin miniprepkit、QIAamp DNA Blood Mini Kit购自QIAGEN公司；M?PER Mammalian Protein Extraction Reagent购自PIERCE公司；Western显色液LumiGLO chemiluminescent reagent and peroxide为Cell Signaling Technology公司产品；鼠抗人hE单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自武汉博士德公司；携带报告基因LacZ的增殖缺陷型腺病毒Ad?LacZ由东方肝胆外科病毒与基因治疗研究室保存。
1.2 腺病毒载体质粒pAd?hE的构建
根据GenBank AF184060基因序列（555bp），在hE基因上下游分别设计引物，上游引物P1: 5’?CGGAATTCACCATGCACAGCCACCGC?3’, 下游引物P2: 5’?GCTCTAGATTACTACTTGGAGGCAGT?3’。引物上下游分别引入EcoRI和XbaI酶切位点。引物由上海基康生物技术公司合成。以pBlast?hEndostatin为模板，P1、P2为引物，对hE基因进行PCR扩增，获得573bp大小的hE基因片段。插入pUC19质粒中，送上海基康生物公司测序。测序正确后，EcoRI＋XbaI酶切片段插入腺病毒载体pCA13的相应酶切位点，并通过PCR方法在hE基因上游引入M?成瘤蛋白的信号肽，构建成功pAd?hE。
1.3 携带hE基因的腺病毒Ad?hE的重组与鉴定
培养293细胞至对数生长期，采用Lipofectamine2000，将质粒pAd?hE与pBGHE3(缺失188～1339bp的5型腺病毒)共转染至293细胞内进行同源重组。转染后10～14d出现病毒空斑，经病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，应用引物P1和P2进行PCR鉴定。鉴定正确者命名为Ad?hE。采用293细胞进行病毒的扩增，以氯化铯梯度离心进行病毒纯化，测定病毒滴度。
1.4 免疫荧光和免疫印迹检测hE在乳腺癌细胞中的表达
在6孔板上接种人乳腺癌细胞株MBD?231和MCF?7，1×104个细胞／孔，以重复感染度（MOI）为10的感染强度，感染重组病毒Ad?hE。继续培养48h后，收集细胞。取少量细胞悬液滴在玻片上，进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察hE的表达。其余细胞以M?PER Mammalian Protein Extraction Reagent裂解后回收蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中70V恒压电泳，分离蛋白质，3V，90mA条件下用电转移仪将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，进行Western Blot检测。
1.5 重组腺病毒表达hE的活性鉴定
以ECV304为靶细胞，接种至6孔板中培养，1×105个细胞/孔，培养24h。以MOI＝100、10、1、0.1、0.01、0分别感染重组腺病毒Ad?hE或Ad?LacZ后继续培养，在病毒感染后第3d, 用10%结晶紫福尔马林溶液固定10min，龙胆紫染色。
2 结果
2.1 腺病毒载体质粒pAd?hE及重组腺病毒Ad?hE的鉴定 见图1A～1B
图1 腺病毒载体质粒pAd?hE及重组腺病毒Ad?hE的鉴定（略）
A: 质粒EcoRI＋XbaI双酶切，1 pCA13；2 pAd?hE；3 Lambda DNA／EcoRI＋HindIII。B：重组病毒PCR扩增，1 100bp DNA Ladder；2 Ad?hE；3 阴性对照；4 pBlast?hEndostatin阳性对照。
2.2 基因表达的鉴定
乳腺癌细胞株MBD?231和MCF?7以MOI＝10感染重组病毒Ad?hE后，进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察hE的表达。结果发现MBD?231和MCF?7细胞株阳性表达hE的百分比分别为（67.3±12.5）%和（46.8±15.6）%，见图2A、2B。
图2 hE基因表达的鉴定（略）
A：免疫荧光标记显示MBD?231细胞感染Ad?hE后hE表达明显。B：Western Blot显示乳腺癌细胞MBD?231和MCF?7感染Ad?hE后hE表达阳性，阳性程度高于100 ng标准对照，而无病毒细胞培养上清阴性。
2.3 重组腺病毒表达hE的活性
ECV304以不同的MOI值感染重组腺病毒Ad?hE后，随MOI的增高，ECV304的生长被明显抑制，而同时感染对照腺病毒Ad?LacZ的细胞的生长不受影响，见图3。
图3 重组腺病毒Ad?hE表达hE的活性（略）
3 讨论
内皮抑素是胶原18的降解产物，降解过程至少包括两步酶解，参与酶解的可能有弹性蛋白酶、组织蛋白酶L和基质金属蛋白酶［4］。内皮抑素能特异性抑制血管内皮细胞在VEGF、bFGF等诱导下的增殖,抑制内皮细胞的迁移，诱导内皮细胞凋亡，但对非内皮细胞，如平滑肌细胞、成纤维细胞等均无抑制作用[5]。内皮抑素这一特点，为抗血管生成的肿瘤基因策略开辟了道路。通过载体转导内皮抑素基因使其在体内长期、稳定表达生物活性高的内皮抑素，这种方法从蛋白质水平转移到基因水平，具有生产简便，在体内表达产物的生物学活性高，可长期表达，有效弥补蛋白治疗的不足，同时降低成本，使患者容易接受［6］。相对非病毒载体，应用病毒载体转染后可获得更高的内皮抑素血浆浓度。
本文成功构建了携带人内皮抑素基因的腺病毒载体。实验证实，该增殖缺陷型腺病毒能够介导内皮抑素基因在人乳腺癌细胞系中高效表达，其表达的内皮抑素具有显著抑制血管内皮细胞生长的活性，在MOI＝10时，已经能够完全抑制血管内皮细胞系ECV304的生长。这一基因治疗载体病毒的构建与重组，为乳腺癌及其他肿瘤的治疗提供了一个有用的方法和思路。抑制肿瘤相关新生血管生成，可以控制肿瘤生长。目前，内皮抑素已进入临床试验，前景广阔［7］。我们在这一领域将进行更深入的研究。
【】
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