人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定
【摘要】 目的 构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法 利用噬菌体表面呈现技术，构建基因文库，经过panning筛选富集后，用ELISA方法检验抗原结合活性。结果 从30个噬菌体克隆中筛选到8个具有肝癌细胞株SMMC7721结合活性的阳性克隆。结论 从外周血淋巴细胞中获取可变区基因，利用噬菌体抗体库技术制备人源抗肝癌单链抗体的策略是可行的。
【关键词】 噬菌体表面呈现技术 单链抗体 肝癌
0 引言
肝癌是我国常见的恶性肿瘤，目前措施是以肝切除术为主的综合治疗。但对于肝癌的早期诊断、治疗疗效尚不理想[1]。单链抗体(ScFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组蛋白,是保持了亲本抗体抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段[2]。构建抗HCC噬菌体抗体库和制备特异性单链抗体具有较大的基础研究价值和广阔的临床应用前景[3]。本实验就是利用噬菌体表面呈现技术,构建了抗人肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库,并从中筛选到有抗原结合活性的抗体。
1 材料和方法
1.1 材料
Trizol试剂、cDNA合成试剂盒和凝胶纯化试剂盒购自Gibco公司，E.coli TG1、pCANTAB?5E、M13KO7 helper phage购自Promega公司，HRP/羊抗M13 噬菌体抗体、T4DNA连接酶、限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ购自Pharmacia公司，TaqDNA聚合酶购自Takara公司，淋巴细胞分离液购自上海生化试剂厂。SOBAG琼脂板，2×YT?AG，2×YT?AK等试剂均自行配制。引物为10种VH和VL引物混合物、与VH基因3′端和VL基因5′端序列互补的linker Primer Mix、带有SfiⅠ酶切位点的VH 5′端引物和带有NotⅠ酶切位点的VL 3′端引物, 引物设计[5],引物合成由北京Sunbiotech公司完成。肝癌细胞株SMMC7721由武汉大学典藏中心提供。30份肝癌患者的外周血标本采自湖北省肿瘤和武汉大学中南医院普外科。
1.2 方法
1.2.1 从肝癌患者外周血中分离淋巴细胞 无菌抽取30例肝癌患者外周血各5ml,于每管中加入3ml淋巴细胞分离液,采用密度梯度离心法分离淋巴细胞。
1.2.2 提取总RNA及cDNA第一链的合成 用Trizol试剂提取淋巴细胞中的总RNA。以oligo(dT)18为引物,用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA。
1.2.3 VH、VL基因的扩增和鉴定 分别以10种VH和VL混合物为引物,以cDNA第一链为模板,加入TaqDNA聚合酶，PCR扩增全套VH、VL基因,反应体积50μl,反应条件为:94℃，1min；55℃，2min；72℃，2min；共30个循环。72℃延伸10min。循环结束后,以1.5%琼脂糖凝胶回收并纯化DNA。
1.2.4 ScFv基因的扩增和鉴定 以与VH基因3′端和VL基因5′端序列互补的linker Primer Mix 为引物,进行重叠延伸反应,将VH、VL随机拼接为ScFv。反应体积50μl,反应条件为94℃，1min；63℃，4min；共7个循环。用SfiⅠ、NotⅠ限制性内切酶切割上述ScFv PCR产物,与相应双酶切的pCANTAB?5E载体片段用T4DNA连接酶连接。
1.2.5 ScFv 基因噬菌体呈现文库的构建 取连接产物转化感受态E.coli TG1,于SOBAG琼脂板上过夜,筛选出转化菌落,用2×YT－AG稀释培养细菌悬液至A600nm=0.3,37℃震荡培养，加入M13k07,离心后于2×YT－AK中过夜,离心收集上清,即为抗人肝癌单链抗体库。
1.2.6 噬菌体抗体库的筛选 在上清中加入PEG/NaCl，取含叠氮钠的封闭液稀释PEG沉淀的重组噬菌体,室温下孵育,加入SMMC7721细胞抗原包被的锥形培养瓶中孵育。PBS、PBST洗瓶。将对数生长期的E.coli TG1加入上述免疫吸附后的培养瓶内孵育。移至50ml细菌培养管中,再加入M13K07,37℃震荡培养,共4轮富集筛选。
1.2.7 噬菌体抗体库抗体特异性测定 将富集的重组菌涂平皿，从中挑选30株单克隆菌株。均加入辅助噬菌体超感染后,置于2×YT?AG中过夜。接种适量SMMC7721细胞于96孔培养板中,待细胞长满孔底后,用0.125%戊二醛室温固定10min,以3%BSA封闭非特异结合部位。每孔加上述噬菌体抗体50μl,经0.05% Tween20?PBS洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体进行结合反应,37℃温育1h,PBS洗板5次,ABTS显色。以M13KO7为阴性对照,测定孔ELISA OD值为阴性孔2～3倍者为阳性。
2 结果
2.1 VH、VL的扩增和鉴定 扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,扩增出的VH基因片段应为340bp,VL基因片段为325bp,实验结果与预期结果相符， 见图1。
2.2 ScFv 基因的拼接、扩增和鉴定 扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳应得到一条约750bp的ScFv片段,实验结果与预期结果相符，见图2。
2.3 噬菌体抗体库的筛选 经对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选,测定噬菌体滴度,每一轮筛选后噬菌体的收获率，噬菌体收获率由第1轮的6.6×10-9% 增到第4轮的1.7×10-6%,共增加了257倍。
图1 全套VH、VL 基因的扩增（略）
图2 ScFv基因的扩增（略）
2.4 Panning筛选及抗原结合活性鉴定 从第4轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选30个克隆,用ELISA测定上清液中噬菌体抗体与SMMC7721细胞结合活性。加入H2O2 -ABTS后,阳性克隆孔中液体变为绿色,阴性孔中液体不变色。显色后,阴性对照孔A410nm值为0.09,有8株ELISA的OD值较高,呈现阳性反应,其A410nm值分布于0.25～0.51之间,阳性克隆检出率约为27%。
3 讨论
部分单克隆抗体，如乳腺癌的抗体Herceptin已进入临床应用中,还有数种抗体也处于临床前实验阶段[5]。然而,由于目前制备的单克隆抗体绝大多数为鼠源性的,对人体有较强的免疫源性,在临床治疗中易引起人抗鼠抗体(HAMA)反应,且其分子量大,血管通透性差,注入人体后在肿瘤部位的积聚量少,给临床应用带来了一定的困难[6]。而用噬菌体抗体展示技术，不经免疫途径而直接从外周血淋巴细胞中获取可变区基因，经RT?PCR扩增出整套的ScFv基因片段,重组于噬菌体中,形成含有全套抗体谱(repertoire)的噬菌体抗体库,再利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、富集,并扩增所需克隆。将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,在大肠杆菌中稳定高效表达，所获得的人源性抗体的免疫源性明显减弱, 使其临床应用成为可能[7]。
本文从肝癌患者外周血淋巴细胞中抽提RNA,经RT?PCR,并采用噬菌体抗体库技术，构建了抗人肝癌全套单链抗体基因文库,从30个克隆中筛选出8个具有抗原结合性的抗体片段。属全人源性抗体,避免了鼠源性抗体所需的人源化等下游工程。在具体的筛选过程中,通常采用纯化抗原包被培养板或在肿瘤细胞表面筛选初级抗体库。本研究中采用SMMC7721细胞抗原包板,对抗体库进行亲和筛选。经过几轮吸附—洗脱—扩增的Panning过程,富集到含特异性抗体片段的噬菌体,筛选到目的克隆。不仅可省去了纯化抗原的繁琐操作,而且有利于保持靶抗原的天然构象。我们认为,这样所获得的抗体能确保与天然状态下的膜表面抗原结合,确保了抗体今后的应用潜力[8]。此外,抗原竞争洗脱法还避免了常用的酸洗脱法对噬菌体活性的影响,有利于下一轮扩增。用噬菌体抗体展示技术筛选到的抗体其亲合力与抗体库容量成正相关，载体的转化效率是制约抗体库容量的主要因素[9],为此我们使用转化率高的电穿孔法进行转化,并增加转化次数以累积库容。
目前,我们已利用噬菌体表面呈现技术构建人源肝癌单链抗体基因库，初步鉴定显示抗体针对肝癌细胞株的亲和活性,为提高ScFv的稳定性，评价其免疫原性等进一研究打下基础。
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