基因芯片在胰腺癌相关基因筛选中的初步研究

【摘要】  目的 探讨基因表达谱芯片技术在筛查胰腺癌相关基因群表达中的作用。方法 按微矩阵排列的4 096种全长基因PCR产物制成BiostarH-40s型微矩阵表达谱芯片；采用一步法抽提胰腺癌及正常胰腺组织总RNA，用Oligotex mRNA离心柱分离纯化两种组织的mRNA；经逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)掺入的cDNA一链制备表达谱探针，芯片杂交和洗片后,用荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像，分析胰腺癌及正常胰腺组织中差异表达的基因。 结果 在4 096种基因中，胰腺癌组织与正常胰腺组织间有949条(23.2%)存在差异表达的基因，其中我们确定了9条上调和8条下调的癌基因和抑癌基因可能与胰腺癌的发病机制存在相关性。结论 基因表达谱芯片技术可以筛选出胰腺癌表达异常的相关基因群，对其进一步研究有助于认识胰腺癌的发病机制。

【关键词】  微矩阵基因芯片 胰腺癌 癌基因 抑癌基因

　　0  引言
   
　　胰腺癌是一种恶性程度高、 预后差的恶性肿瘤。 由于胰腺癌早期无特异性临床症状， 发现时大部分已属中、 晚期， 其5年生存率仅为1%～5%。 近年来， 胰腺癌发病率呈逐年上升趋势， 由于胰腺癌晚期效果差， 早期诊断可使更多患者获得手术切除的机会而提高其生存率。 然而， 现有的影像学检查技术尚不能达到早期诊断的目的， 胰腺癌相关的血清学标志物尚不能准确反应肿瘤的发生、 情况。 故近几年发展起来的肿瘤相关基因检测技术为胰腺癌的早期诊断提供一种新的途径。 本实验主要通过基因表达谱芯片技术检测胰腺癌和正常胰腺组织中基因群表达的不同， 筛选出相关的基因为进一步深入研究其在胰腺癌的发生、 发展中的作用提供线索。

　　1  材料和方法

　　1.1  临床标本
   
　　1例经病理证实的胰腺癌新鲜标本及癌旁对照胰腺组织由南通大学附属普外科提供。分别于标本切取后立刻(10min内)将所取组织放入液氮中冻存备用。

　　1.2  表达谱芯片的制备
   
　　用载体两端通用引物对4 096条全长基因进行PCR扩增，产物长度为1 000～3 000bp，琼脂糖电泳监控PCR质量。浓缩后的扩增产物作为靶基因溶解于点样液中，用Cartesian Pixsys7500点样仪点在硅烷化玻片上。点样后玻片进行2h水合、室温干燥30min，再用0.2% SDS、水及0.2%硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。

　　1.3  探针制备
   
　　采用条件优化的一步法抽提胰腺癌和正常胰腺组织总RNA，将RNA沉淀溶解在RNase?free的Milli?Q水中，测D(260)/D(280)，D(260)/D(230)。按Qiagen公司Oligotex mRNA spin?column操作进行RNA纯化。在50μl逆转录反应体系中加入3μg  mRNA，逆转录合成及纯化cDNA探针，用Cy3?dUTP标记正常组织mRNA，用Cy5?dUTP标记癌组织mRNA。乙醇沉淀后将Cy3?dUTP和Cy5?dUTP标记的探针混合溶解在20μl 5×SSC+0.2% SDS杂交液中。

　　1.4  杂交和洗涤
   
　　将表达谱芯片和杂交探针分别做95℃变性30秒和2min后置于杂交舱内，立即将探针加在基因芯片上，用杂交密封舱加以密闭，不留有气泡。于恒温杂交箱内42℃杂交18h。然后揭开盖玻片，按顺序用2×SSC+0.2% SDS、0.1%×SSC+0.2%SDS、0.1%×SSC洗涤10min,室温晾干。

　　1.5  差异基因检测与生物学信息分析
   
　　ScanArray 4000扫描仪扫描芯片，得到的Cy3/Cy5图像文件通过划格确定杂交点范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值。为了避免系统误差，实验数据进行均一化处理。均一化处理时先依据以下2个原则筛选出参与均一化处理的有效基因点：(1)该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800；(2)该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值在0.1～10之间。用GenePix Pro 3.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，筛选出比值大于2或小于0.5的基因点，所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异，且上下调趋势一致，程度相似。

　　2  结果

　　2.1  总RNA抽提和mRNA纯化 
   
　　从胰腺癌和正常胰腺组织中提取总RNA后琼脂糖凝胶电泳结果分析RNA，8SrRNA和28SrRNA条带清晰，两者比例约为1∶2.5，说明所提取的胰腺癌和正常胰腺组织的总RNA完整性好。

　　2.2  基因芯片杂交结果
   
　　正常胰腺组织表达谱(Cy3)扫描结果与胰腺癌组织表达谱(Cy5)扫描结果经机数据叠加后产生的图像(见图1)。该图反映的是每个基因在不同组织中表达丰度的比值，反映了癌组织和正常组织间基因表达的差异。黄色点代表该基因表达丰度在两种组织中接近；红色点代表该基因在胰腺癌组织中表达较正常胰腺组织中高表达(上调趋势)；绿色点代表该基因在胰腺癌组织中表达较正常胰腺组织中低表达(下调趋势)。

   
　　Scatterplot分布(见图2)见芯片上绝大多数基因在两种组织中的表达丰度是一样的，但存在少数差异基因点(黄色)，其在表达谱芯片上的信号差异大于2倍。

　　2.3  生物信息学分析结果 
   
　　生物信息学分析发现有差异表达的基因949条占基因总数(4096条)的23.2%，其中属于原癌基因和抑癌基因17条(0.42%)，表达上调的有9条(平均ratio值为3.68)，表达下调的有8条(平均ratio值为0.30) (见表1)。

　　表1  胰腺癌组织中表达异常的癌基因和抑癌基因（略）
　　
　　3  讨论
   
　　实际上，肿瘤的发生大多是肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致。原癌基因是生长因子信号系统的组成成分，在恶性肿瘤中其改变常为点突变、扩增、染色体转位、基因剪切等。许多原癌基因的表达产物对细胞膜的稳定、受体的活性、信号传递、酶的活性和基因的表达具有显著的调节作用。抑癌基因是正常的细胞基因，有诱导组织分化、细胞凋亡和调节细胞生长等功能，一旦突变和缺失，可导致癌发生。现已发现与胰腺癌发生有关的主要抑癌基因有p53、p16、DPC4、APC、DCC、RB、NM23等。本研究发现在胰腺癌组织与正常胰腺组织间有显著差异表达的基因中，就有很多癌基因和抑癌基因可能与胰腺癌的发生和过程有着密切的关系。
   
　　表达下调的基因中，006698 BLCAP(Homo sapiens bladder cancer associated protein)基因，又称bcl0，编码人类膀胱癌相关蛋白。1999年，该基因首先由国外学者用差异筛选方法从侵袭性不同的膀胱癌细胞中筛选发现。2002年Gromova等[1]利用mRNA差异显示技术克隆到该基因，RT—PCR结果表明该基因在非侵袭性病变中过度表达，认为其在肿瘤进展中起相当的作用。对BLCAP基因同源性检索发现了几条同源性较高的基因，这些基因都与细胞生长调控相关，鉴于BLCAP基因与这些基因结构的相似性，且不同种属间BLCAP基因序列相当保守，可以推测BLCAP基因为一个调节细胞生长的十分重要的看家基因，其功能的失调可能导致细胞生长失控，引起细胞的恶变[2]。多项研究表明在膀胱癌侵袭过程中BLCAP基因表达下调；同时Fan等[3]的研究表明BLCAP基因反义的寡核苷酸对人骨肉瘤细胞生长速度和集落形成能力有明显促进效应，提示BLCAP基因也是人骨肉瘤的抑癌基因。本研究显示胰腺癌组织中BLCAP基因表达明显下调，该基因可能在胰腺癌的生长和转移中也起了一定的作用。
   
　　007295乳腺癌易感基因(BRCAl基因)，定位于人染色体17q21，编码1863个氨基酸的蛋白质。BRCAl作为一种抑癌基因，能通过多条信号转导途径抑制细胞增殖、细胞生长，诱导细胞凋亡和参与细胞DNA损伤修复，维持基因组的完整，是一个重要的细胞周期负调控子。BRCAl具有肿瘤抑制基因的作用，能与多个抑癌基因相互协调，抑制肿瘤的生长。BRCAl基因还有多个c?myc、p53、pRB、P300、E2F等基因的结合位点，启动或抑制这些基因能促进或抑制DNA的损伤修复。而BRCAl基因的突变则导致BRCAl编码的蛋白质从细胞核进入细胞质中，丧失了与DNA结合的能力。目前认为BRCAl基因对细胞生长增殖起负调控作用，其结构和功能的异常是细胞恶变的一种重要原因。同时，BRCAl基因受雌激素的调控，具有组织特异性，其突变和低表达是诱发乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的主要原因之一[4?6]。在本研究结果中，BRCAl基因表达明显下调，很可能是胰腺癌细胞无限增殖的原因之一。
   
　　表达上调的基因中，001910 组织蛋白酶E基因(Cathepsin E基因)，编码一种溶酶体酸性蛋白酶,属于组织蛋白酶家族中的一员。Azuma等[7]的研究表明胰腺胆管腺癌患者的胰腺组织可检测到Cathepsin E的表达，以及胰液中Cathepsin E的阳性率很高，提示Cathepsin E是诊断胰腺癌的有效标记物。目前对组织蛋白酶E的研究较少，但Cathepsin D在乳腺癌、食管鳞癌和胃癌组织的表达阳性率高,且对预后有指导意义[8,9]。Cathepsin D对基底膜的多种成分如纤维连接蛋白、层连接蛋白、各种类型胶原、蛋白粘多糖的核心蛋白等均有降解破坏作用,在恶性肿瘤的浸润和转移机制上起重要作用[10]。另外，Cathepsin B、D参与了不同的凋亡模型，表明组织蛋白酶在凋亡信号传导过程中起了重要作用。本研究结果提示，组织蛋白酶E明显上调，该酶可能在胰腺癌的浸润和转移过程中起一定作用。
   
　　目前，国内外对胰腺癌相关基因的研究主要是将一个癌基因或可能的抑癌基因转到培养细胞或转基因动物中，或把某一基因进行敲除(knockout)以观察生理或病理变化。但是，由于肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程，在其中至少有2种或2种以上癌基因参与。本研究结果表明，共有17条癌基因和抑癌基因在胰腺癌发生和发展过程异常表达，很可能存在着互相协调的共同表达的基因群。因此利用基因表达谱芯片技术对胰腺癌进行基因群水平研究，筛选在肿瘤相关的多个环节上起重要作用的分子和起关键调节作用的基因，以揭示胰腺癌在基因水平上的本质，为胰腺癌的早期诊断和早期提供理论依据。 

【】
  　　［1］ Gromova I, Gromov P, Celis JE. bc10: A novel human bladder cancer-associated protein with a conserved genomic structure downregulated in invasive cancer[J]. Int J Cancer, 2002, 98(4):539?546.

　　［２］ 刘娟, 熊金虎, 伍欣星. 宫颈癌相关blcap基因的生物信息学分析［J］. 病毒学, 2004, 19 (2):168?170．

　　［３］ De?Gang Fan, Qing?Yu Fan, Hui?Zhong Zhang, et al. A prospective genetic therapy study of extremity saving operations: the regulatory function of gene BLCAP in the development of human osteosarcoma［J］. Chinese Journal of Clinical Rehabilitation, 2004, 8(3):982?983.

　　［４］ Neuhausen SL, Ostrander EA. Mutation testing of early?onset breast cancer genes BRCA1 and BRCA2［J］. Genet Test, 1997, 1(2):75?83.

　　［５］ Vissac C, Peffault De Latour M, Communal Y, et al. Expression of BRCA1 and BRCA2 in different tumor cell lines with various growth status［J］. Clin Chim Acta, 2002, 320(1?2):101?110.

　　［６］ Fan S, Wang J, Yuan R, et al. BRCA1 inhibition of estrogen receptor signaling in transfected cells［J］. Science, 1999, 284(5418):1354?1356.

　　［７］ Azuma T, Hirai M, Ito S, et al. Expression of cathepsin E in pancreas: a possible tumor marker for pancreas, a preliminary report［J］. Int J Cancer, 1996, 67(4):492?497.

　　［８］ Isola J, Weitz S, Visakorpi T, et al. Cathepsin D expression detected by immunohistochemistry has independent prognostic value in axillary node?negative breast cancer［J］. J Clin Oncol， 1993, 11(1):36?43.

　　［９］ 许良中,沈镇宙,朱伟萍,等. 组织蛋白酶D、C?erbB?2和表皮生长因子受体在乳腺癌组织中的表达及其与淋巴结转移的关系［J］.中华肿瘤杂志, 1995, 17(1):60?63.

　　［１０］Schwartz MK. Tissue cathepsins as tumor markers[J]. Clin Chim Acta, 1995, 237(1?2):67?78.