DNA双链断裂修复蛋白在宫颈癌和CIN组织中的表达
作者：庄亮，于世英，黄晓园，熊慧华，李伟，曹阳，冷彦
【摘要】 目的 研究DNA双链断裂修复蛋白（Ku80、DNA?PKcs和ATM）在宫颈癌和宫颈上皮内瘤样病变（CIN）组织中的表达情况，探讨3种蛋白在宫颈癌发生中的作用及相互关系。方法 应用免疫组化SP法检测41例宫颈癌组织和15例CIN组织中Ku80，DNA?PKcs和ATM蛋白的表达情况。结果 Ku80、DNA?PKcs和ATM蛋白在宫颈癌患者中的阳性率分别为70.7％、68.3％和19.5％，在CIN患者中的阳性率分别为80.0％、73.3％和33.3％；3种蛋白在宫颈癌组织中的表达均低于CIN组织，但差异无统计学意义（P>0.05）。3种蛋白的表达在不同年龄、病理类型、分化程度和临床分期的宫颈癌患者中差异无统计学意义（P>0.05）。Spearman等级相关分析，在56例患者中，Ku80与DNA?PKcs的表达呈正相关（r＝0.583，P＝0.000）；Ku80与ATM的表达亦呈正相关（r＝0.274，P＝0.041）。结论 3种蛋白可能未在宫颈癌的发生发展中起主要作用；Ku80与DNA?PKcs及与ATM之间存在密切关系。
【关键词】 Ku80；DNA?PKcs；ATM；宫颈癌；宫颈上皮内瘤样病变
放射线主要是通过导致DNA双链断裂（DNA double?strand break，DSB）起到杀死肿瘤细胞的作用，但细胞都有不同程度的DSB修复能力，修复方式有两种：以DNA依赖蛋白激酶（DNA?dependent protein kinase，DNA?PK，包括Ku80/Ku70异二聚体和DNA?PK催化亚单位DNA?PKcs）为主的非同源性末端连接（DNA nonhomologous end?joining，NHEJ）和以ATM（Ataxia?telangiectasia mutated）为主的同源重组（homologous recombination）修复[1]。本实验将检测Ku80、DNA?PKcs和ATM蛋白在宫颈癌组织和宫颈上皮内瘤样病变（cervical intra?epithelial neoplasia，CIN）中的表达，研究3种DSB修复蛋白在宫颈恶性病变及癌前病变中的表达差异及相互关系，探讨其在宫颈癌发生发展过程中的作用，为临床提供依据。
1 材料与方法
1.1 一般资料
随机选取我院1998年3月～1999年12月确诊的宫颈癌患者41例，其中鳞癌35例，腺癌5例，腺鳞癌1例；按FIGO分期Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ期分别为2例、6例、8例、2例、23例和0例；年龄24～78岁，中位年龄50岁。同时随机选取我院2002年确诊的CIN患者15例，年龄26～69岁，中位年龄46岁。上述患者病理检查前均未接受放化疗。
1.2 免疫组化检测蛋白表达
Ku80（稀释度1∶250）、DNA?PKcs（稀释度1∶200）及ATM（稀释度1∶20）单抗均为美国Neomarkers公司产品；SP试剂盒、显色剂DAB购自北京中山公司。免疫组化染色按SP试剂盒说明书进行，PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。DNA?PKcs和Ku80蛋白表达于胞核；ATM主要表达于胞核，部分表达于胞浆。根据着色程度分别记0分、1分、2分、3分。阳性细胞<10%记0分，10%～24%记1分，25%～49%记2分，≥50%记3分。综合判定取着色强度和阳性细胞百分数分值之积：0分为阴性，记为（-）；1分以上为阳性，其中1、2分记为（+），3、4分记为（++），6、9分记为（+++）。
1.3 统计学方法
SPSS11.5软件进行χ2检验及Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各蛋白在宫颈病变组织的表达
41例宫颈癌患者中，Ku80、DNA?PKcs和ATM的阳性率分别为70.7％（29/41）、68.3％（28/41）和19.5％（8/41），阳性表达情况见图1～3。15例CIN患者中Ku80、DNA?PKcs和ATM的阳性率分别为80.0％（12/15）、73.3％（11/15）和33.3％（5/15），阳性表达情况见图4～6。NHEJ途径修复蛋白Ku80和DNA?PKcs在宫颈癌组织和癌前病变中表达均较高，且癌前病变高于癌组织表达，但差异没有统计学意义（P>0.05）。HR途径修复蛋白ATM在这两种宫颈病变中表达均比较低，虽在CIN患者中的表达率高于宫颈癌，但差异亦无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.2 各蛋白的表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系
Ku80、DNA?PKcs和ATM的表达与宫颈癌患者的年龄（以中位年龄50岁为界）、组织病类型（将腺癌和腺鳞癌合并）、分化程度和临床分期（将Ⅰ期、Ⅱa期合并，Ⅱb期、Ⅲa期和Ⅲb期合并）均无相关性（P>0.05），见表2。
2.3 各DSB修复蛋白在宫颈病变组织中的表达存在相互联系
由于41例宫颈癌患者与15例CIN患者中3种蛋白的表达差异无统计学意义，故将这56例宫颈病变患者的蛋白表达合并分析：Ku80表达情况为:表1 Ku80、DNA?PKcs和ATM在宫颈癌和CIN组织中的表达表2 Ku80、DNA?PKcs和ATM的表达与41例宫颈癌患者临床病理特征的比较将各蛋白的表达水平做Spearman等级相关分析发现，Ku80与DNA?PKcs的表达呈正相关，相关系数r＝0.583，P＝0.000；Ku80与ATM的表达亦呈正相关，相关系数r＝0.274，P＝0.041；ATM与DNA?PKcs间相关系数r＝0.254，但P＝0.059，提示两者无相关。说明Ku80与其它两种蛋白在表达上存在着密切的关系。
3 讨论
放射线引起的DSB由HR和NHEJ两条途径进行修复，以DNA?PK为代表的NHEJ修复是人类最主要的修复途径[2，3]。当放射线引起DSB时，Ku80和Ku70迅速形成异源二聚体，与受损DNA末端结合，激活DNA?PKcs，引发一系列反应完成修复[4]。我们的结果显示宫颈病变组织中（不管是癌组织还是癌前病变组织），DNA?PK的组成部分Ku80和DNA?PKcs表达都较高，而ATM的表达均低，这也符合NHEJ修复途径在人类组织中处于主要地位的事实。体外实验已证实Ku80、DNA?PKcs和ATM阻断后细胞对放射线敏感性增加[2，5，6]，但一个基因要成为的靶点，其在肿瘤组织中的表达水平一定要相对较高，否则就失去靶向治疗的意义。本研究显示Ku80和DNA?PKcs的表达远高于ATM，可以认为在宫颈癌中，DNA?PK相对于ATM更有可能成为放疗增敏的靶向抑制基因。
我们的研究还显示，三种DSB修复蛋白虽在宫颈癌中的表达均低于宫颈癌前病变,但差异无统计学意义，与先前国内外的报道有不合之处。一般认为，DSB修复蛋白的表达下降可以导致细胞的基因组不稳定，使细胞癌变的危险性增加。国内报道认为，Ku80和DNA?PKcs的表达下降在肺癌形成和过程中起作用[7]；国外报道，DNA?PKcs的表达变化在结直肠腺瘤发展成腺癌过程中未起作用，但Ku80蛋白的表达下降却是结直肠腺瘤发展成腺癌的重要过程[8]。我们的结果与上述报道不尽一致，可能原因是肿瘤组织起源不同，DSB修复蛋白的作用存在差异，三种蛋白的表达下降在宫颈癌的发生发展中未起主要作用，但仍需增大样本数验证本结论。
Ku80、DNA?PKcs和ATM的表达在与宫颈癌患者临床病理特征的比较结果中可以看到，这三种蛋白的表达与宫颈癌患者的年龄、组织病类型、分化程度和临床分期等指标无关，而这些指标或多或少可以预示宫颈癌患者的预后，这些结果说明DSB修复蛋白是一个独立于宫颈癌患者临床病理特征之外的新的生物学指标。
在DSB产生后，信号转导途径将分为三个阶段来感知和修复DSB：①外来损伤信号感知；②信号级联反应；③产生最终效应，损伤修复。各阶段蛋白相应的称为“感受器”（sensor）、“转导蛋白”（signal transductor）和“效应器”（effector）。已经证实，ATM基因和Ku基因在这两种修复机制中分别起着上游“感受器”作用[9]。我们将蛋白的表达水平做Spearman等级相关分析后发现，ATM与Ku80的表达呈正相关，这说明同一个患者的两条DSB修复通路对DSB的感受敏感度是一致的。DNA?PKcs与Ku80的表达亦呈正相关，这与Ku80和DNA?PKcs都是DNA?PK的组成部分这个事实相符。
【文献】
［1］ Van Gent DC, Hoeijmakers JH, Kanaar R. Chromosomal stability and the DNA double?stranded break connection/[J/]. Nat Rev Genet, 2001, 2(3): 196?206.
/[2/] Collis SJ, DeWeese TL, Jeggo PA, et al. The life and death of DNA?PK/[J/]. Oncogene, 2005, 24(6): 949?961.
/[3/] Lieber MR, Ma Y, Pannicke U, et al. Mechanism and regulation of human non?homologous DNA end?joining/[J/]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4(9): 712?720.
/[4/] Valerie K, Povirk LF. Regulation and mechanisms of mammalian double?strand break repair/[J/]. Oncogene, 2003, 22(37): 5792?5812.
/[5/] Belenkov AI, Paiement JP, Panasci LC, et al. An antisense oligonucleotide targeted to human Ku86 messenger RNA sensitizes M059K malignant glioma cells to ionizing radiation, bleomycin, and etoposide but not DNA cross?linking agents/[J/]. Cancer Res, 2002, 62(20): 5888?5896.
/[6/] Shinohara ET, Geng L, Hallahan DE, et al. DNA?dependent protein kinase is a molecular target for the development of noncytotoxic radiation sensitizing drugs/[J/]. Cancer Res, 2005, 65(12): 4987?4992.
/[7/] 张霞,周晟,吕斌，等. 肺癌组织中DNA修复酶MGMT、DNA?PKcs和Ku的表达变化/[J/]. 环境与职业医学,2003,20(2): 75?77.
/[8/] Basil R, Simona B, Abdelmonem E, et al. Decreased expression of DNA?dependent protein kinase, a DNA repair protein, during human colon carcinogenesis/[J/]. Cancer Res, 2001, 61(23): 8381?8384.
/[9/] Walker JR, Corpina RA, Goldberg J. Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double?strand break repair/[J/]. Nature, 2001, 412(6847): 607?614.
