脂氧合酶在胃癌中的表达及其意义

            作者：李建英，李 勇，王小众，邹来玉，陈丰霖

【摘要】  目的 检测5?脂氧合酶(5?lipoxygenase,5?LOX)和15?脂氧合酶?1(15?lipoxygenase?1,15?LOX?1)mRNA及蛋白在胃癌及癌旁正常组织中的表达，并研究两者间的关系。方法 采用RT?PCR和western blot检测胃癌组织及相匹配的癌旁正常组织中5?LOX、15?LOX?1 mRNA和蛋白的表达。结果5?LOX mRNA及蛋白在胃癌组织中的表达均显著高于癌旁正常组织(P＜0.05)，而15?LOX?1 mRNA及蛋白在胃癌组织中的表达均显著低于癌旁正常组织(P＜0.05)。5?LOX与15?LOX?1在胃癌组织中的表达无明显相关(P＞0.05)。结论 胃癌组织中存在5?LOX和15?LOX?1的表达失衡，且可能与胃癌的发生有关，但二者之间无相关性。

【关键词】  胃肿瘤；5?LOX ；15?LOX?1；逆转录?聚合酶链反应；免疫印迹

    研究表明，多不饱和脂肪酸代谢与肿瘤的发生密切相关，各种脂氧合酶同工酶在其中具有不可忽视的作用，已逐渐成为我们肿瘤的新靶点。近几年来，国内外研究人员对于脂氧合酶代谢途径在肿瘤发生过程中的作用已经进行了深入研究，5?LOX和15?LOX?1是其中的关键酶。尽管5?LOX已经被证实在多种肿瘤组织和细胞系中表达升高，但在胃癌组织中的研究报道极少。在5?LOX的促癌作用逐渐得到人们认同的同时，15?LOX?1在肿瘤发生过程中的作用仍未达成一致共识，在胃癌中的研究更是少见报道。因此，我们应用RT?PCR和western blot方法检测胃癌及癌旁正常组织中5?LOX、15?LOX?1 mRNA和蛋白表达，探讨二者在胃癌形成中的作用，为胃癌的有效治疗和预防提供新的思路。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    收集30例2005年6月～2006年1月间外科手术切除胃癌组织及距肿瘤边缘5cm癌旁正常胃黏膜组织（经病理证实）。液氮保存用于做RT?PCR及western blot研究。其中女5例，男25例，平均年龄58.0岁。羊抗人5?LOX多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司（SC?8885）, 兔抗山羊二抗购于北京中山生物技术有限公司。绵羊抗人15?LOX?1多克隆抗体购于美国Cayman公司（160704），兔抗绵羊二抗购于KPL公司。

    1.2  方法

    1.2.1  RT?PCR检测  RNA的提取按RNA提取试剂盒说明书规范操作提取组织总RNA，然后进行定量、检测纯度等。取RNA样品2μg，42℃ 60min，99℃ 5min合成cDNA。5?LOX基因上游引物: 上游引物5＇?CCCGGGGCATGGAGAGCA?3＇，下游引物:5＇?GCGGTGGGGCAGCGTGTC?3＇； 416bp。 15?LOX?1基因上游引物: 5＇?GCTGGAAGAGAGAAGGAAGTTG?3＇，下游引物：5＇?GAAGTCAGCTTCGAACAGTGTG?3＇，485bp。内参β?actin基因上游引物：5＇?CTATTGGCAACGAGCGGTTC?3＇, 下游引物：5＇?CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT?3＇,776 bp。取1μl cDNA进行PCR扩增（反应体系25μl）。5?LOX基因扩增条件：94℃ 3min,94℃ 30s,63℃ 30s,72℃ 1min,32个循环；72℃ 7min。15?LOX?1基因扩增条件：94℃ 3min,94℃ 45s,57℃ 45s,72℃ 1min,35个循环,72℃ 7min。取8μl PCR 产物,经1.2%琼脂糖凝胶（含0.5g/l溴化乙锭）电泳分离,紫外灯下观察结果。

    1.2.2  western blot检测  将新鲜组织于冰盒上研磨，加入组织蛋白裂解液(1%NP40，1%去氧胆酸钠，1%SDS，150mM NaCl，50mM Tris，1μg/ml亮肽素leupeptin，1μg/ml抑肽酶Aprotinin，1μg/ml抑肽素Pepstatin，0.1μg/ml 苯甲基磺酸酰氟PMSF)1000μl ,充分混匀。4℃、12 000g 离心20min ,收集上清。Bradford 比色法测定蛋白浓度。每孔25μg 蛋白上样,10 % SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白印迹包括电转膜、5%脱脂奶粉封闭、TBST稀释的一抗4 ℃过夜(5?LOX、15?LOX?1抗体浓度分别为1∶200、1∶1000)、二抗(1∶6000) 室温轻摇60min ,用化学发光试剂盒（北京中山生物技术有限公司）进行蛋白信号检测。β?actin作为内对照。

    1.3  统计学处理

    采用SPSS11.0统计分析软件进行χ2检验、Spearman’s 等级相关检验。P<0.05为有统计学差异。

    2  结果

    2.1  5?LOX和15?LOX?1 mRNA 在胃癌组织与癌旁正常组织中的表达

    RT?PCR产物电泳后观察，30例胃癌组织与癌旁正常组织中均可测到776bp的β?actin，结果见表1、2，图1、2。

    2.2  5?LOX和15?LOX?1蛋白在胃癌组织与癌旁正常组织中的表达

    在western blot实验中，30例胃癌组织与癌旁正常组织中均可测到42kD的β?actin蛋白，结果见表3、4，图3。表1  胃癌组织与癌旁正常组织中5?LOX mRNA的表达表2  胃癌组织与癌旁正常组织中15?LOX?1 mRNA的表达  表3  胃癌组织与癌旁正常组织中5?LOX蛋白的表达表4  胃癌组织与癌旁正常组织中15?LOX?1蛋白的表达由表5可见, 两者蛋白水平表达无明显相关性（P＞0.05）。表5  胃癌组织中5?LOX蛋白和15?LOX?1蛋白表达的相关性

    3  讨论

    胃癌是起源于胃上皮的恶性肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一，尽管国内外对胃癌已做了大量的研究，但其病因和发病机制仍未阐明。我们知道，环氧合酶在胃癌形成过程中发挥着关键作用[1,2]，近年来更有报道表明环氧合酶抑制剂的抗肿瘤作用可能涉及脂氧合酶途径，提示脂氧合酶代谢途径在胃癌形成过程中可能扮演着更为重要的角色[3]。

    研究表明，脂氧合酶共可分为4型：5?LOX、8?LOX、12?LOX、15?LOX，其中15?LOX可根据其组织分布的特异性分为两种同工酶15?LOX?1、15?LOX?2[4?6]。目前有关5?LOX的研究报道较多，发现5?LOX及其主要下游产物5?HETE和LTB4在各种上皮来源的恶性肿瘤中高表达，例如结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌，5?LOX抑制剂通过诱导凋亡抑制细胞增殖，5?LOX促癌作用主要与其代谢产物5?HETE和LTB4有关[7?11]。相对于5?LOX而言，15?LOX?1在肿瘤发生过程中的作用尚未明确，但有报道提示15?LOX?1对肿瘤的形成有一定抑制作用。Shureiqi等[12?14]在结直肠癌及食管癌中的研究发现，15?LOX?1及其产物13?HODE在结肠直肠癌中表达显著低于相应的癌旁组织，13?HODE通过抑制增殖诱导凋亡发挥抗肿瘤活性，认为结直肠癌的发生与15?LOX?1及其产物表达下降有关。另有一些研究支持这一结论[15?17]。虽然有关5?LOX和15?LOX?1在肿瘤中的研究较多，但在胃癌中的相关研究报道少见。

    本实验采用RT?PCR和western blot方法研究发现胃癌组织中5?LOX mRNA和蛋白表达均明显高于癌旁正常胃组织，而15?LOX?1 mRNA和蛋白的表达在癌旁正常胃组织中显著增高，从转录和翻译水平证实5?LOX在胃癌组织中高表达，15?LOX?1在胃癌组织中低表达，此结果与上述研究结论相一致。因此，我们认为在胃癌中5?LOX和15?LOX?1表达存在着失平衡，可能与胃癌的发生过程有关。那么，作为花生四烯酸代谢过程中的两个关键酶，两者在胃癌组织中表达的差异是否与两者间的相互作用有关呢？

    LOX家族中以15?LOX?1为主的抗癌代谢与以5?LOX、12?LOX为主的促癌代谢间存在动态平衡。在肿瘤发生过程中，促癌代谢活性增强，抗癌代谢活性降低。在上调5?LOX及其产物表达的同时，15?LOX?1及其产物表达降低。有报道称，IL?4可促进肿瘤细胞中15?LOX?1的表达，并诱导细胞凋亡[18]。Spanbroek等[19]在免疫细胞实验中发现IL?4在上调15?LOX?1促进凋亡的同时也抑制5?LOX活性，提示5?LOX与15?LOX?1之间可能存在相互作用。

    通过进一步研究我们发现，胃癌组织中5?LOX和15?LOX?1表达水平间的相关指数为?0.154，无统计学意义。提示5?LOX和15?LOX?1间无相关性，在胃癌形成过程中不涉及两者间直接的相互作用。有资料显示，15?LOX?1促进分化，抑制生长及诱导凋亡的作用与其他LOX的促癌作用之间相互影响，其中涉及其产物间的直接作用。15?HETE（15?LOX?1的主要产物）具有的抗肿瘤效应主要通过拮抗其他LOX产物而实现，包括抑制LTB4产生与血小板型12?LOX的活动，降低5?LOX活性，并减少LTB4与其受体结合而抑制对LTB4的细胞应答，提示LOX产物间在肿瘤形成过程有着重要作用[20]。

    那么5?LOX和15?LOX?1在胃癌形成中的具体作用是什么？两者在胃癌中表达的失衡是否涉及产物间的相互作用？这些问题均有待于我们进一步深入研究。

【】
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