食管癌术后早期肠内营养并发乳糜胸19例报告

             作者：廖爱军，苏琦，田锋，姚育红，曾斌　

【摘要】  目的 探讨湖南衡阳地区白细胞介素?1B（IL?1B）基因多态性与胃癌的关系以及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP）感染后胃癌发生的易感基因型。方法 52例胃癌患者癌旁正常胃粘膜组织和55例慢性胃炎患者胃粘膜组织，均经快速尿素酶和PCR检测HP，应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（PCR?RFLP）分析技术，进行基因型检测，并对C/C、T/T进行测序，比较各基因型在胃癌组和胃炎组中的分布差异。结果 IL?1B?31T、IL?1B?511T等位基因和IL?1B?31T/T、IL?1B?511T/T基因型在胃癌组的分布频率高于胃炎组(P<0.05)，OR值分别为1.97(95%CI=1.15～3.59)、2.52(95%CI=1.45～4.39)和2.71(95%CI=1.10～6.66)、3.33(95%CI=1.14～9.73)。在伴有HP感染的群体中进行比较，IL?1B?31位点各基因型未见明显差异；但IL?1B?511T等位基因和IL?1B?511T/T基因型在胃癌组的分布频率高于胃炎组(P<0.05)，OR值分别为2.16(95%CI=1.10～4.23)和3.43(95%CI=1.01～11.62)。结论 在湖南衡阳地区IL?1B?31T/T、IL?1B?511T/T基因型与胃癌发病风险相关，在HP被感染后IL?1B?511T/T基因型可能为湖南衡阳地区胃癌易感基因型。

【关键词】  白细胞介素?1B；基因多态性；胃癌；幽门螺杆菌

    胃癌是由环境因素和遗传因素共同引发的恶性肿瘤。在环境因素中，HP感染是主要因素，被认为是胃癌发生的启动因素和促进因素。目前世界上已有半数以上的人被HP感染，但其中大多数为无症状感染者，只有极少数成胃癌，因而认为存在这些差别的原因既有HP本身的因素，也有宿主本身的因素。

    为此，本实验在湖南衡阳地区以慢性胃炎患者作为对照，探讨该地区患者被HP感染后IL?1B?31和IL?1B?511基因多态性与胃癌发生的关系。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    实验组：72例胃癌标本均来自2005年3月～2005年12月南华大学附一，经病理确诊(贲门癌除外)，所有病例术前均未行放疗或化疗，术前2周未口服抗生素。取胃窦部约0.5g癌旁正常粘膜组织(距癌灶>5cm)分为2块，1块行快速尿素酶检测HP,1块切成米粒大小置于-80℃冰箱冻存。实验组及对照组患者均来自于湖南衡阳地区。

    对照组：70例标本来自本院胃镜室活检组织，无系统性红斑狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎和胃癌家族史，术前2周未口服抗生素治疗,病理确诊为慢性浅表性胃炎。取胃窦粘膜组织2块，1块行快速尿素酶检测HP，1块置于-80℃冰箱冻存。

    1.2  实验方法

    1.2.1  基因组DNA的提取

    实验组胃窦部癌旁正常粘膜组织和对照组胃窦部粘膜组织，各取米粒大小一块，分别放入无菌EP管中用无菌眼科剪剪碎，按照上海生工DNA抽提试剂盒要求操作，DNA提取后于-20℃冰箱中保存。

    1.2.2  HP的检测

    （1）快速尿素酶法检测HP  试剂盒由福建三强公司提供，按试剂盒要求操作，加入组织样本后5min内颜色逐渐变红为阳性，不变色则为阴性。

    （2）PCR检测幽门螺杆菌(HP) UreA基因  试剂盒由上海生工提供，引物参照[1]由上海生工合成，上游：5’GCCAATGGTAAATTAGTT3’；下游：5’CTCCTTAATTGTTTTTAC3’；扩增出的UreA基因片段长度为411bp。反应体系为25μl，包括PCR Master 12.5μl，上、下游引物各1μl，模板DNA1μl,去离子水9.5μl。反应条件为94℃ 5min 1个循环；94℃ 1min，47℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。产物于2%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳，100V恒压30min，紫外灯下观察结果。出现411bp橙色条带的为HP阳性，无条带则为阴性，见图1。

    (3)诊断标准及检测结果  所有标本经两种方法检测HP，两种方法同为阳性则为HP阳性，同为阴性则为HP阴性，一阳一阴者剔除。最后测出实验组标本52例，对照组标本55例。

    1.2.3  基因多态性检测

    (1)IL?1B?31和IL?1B?511位点PCR扩增  引物由上海生工合成，序列为：IL?1B?31上游：5＇

    M：100bpDNA marker；1?4：HP阳性结果；5：阴性结果

    图1  HP?UeaA基因检测结果照片

    AGAAGCTTCCACCAATACTC3’下游：5’AGCACCTAGTTGTAAGGAAG 3’。IL?1B?511 上游：5’TGGCATTGATCTGGTTCATC 3’下游：5’GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3’。扩增体系均为25μl，包括PCR Master 12.5μl，上、下游引物各1μl，模板DNA 1μl,去离子水9.5μl。反应条件为94℃ 5min 1个循环；94℃ 30s，57℃ 40s ，72℃ 45s，35个循环；72℃延伸10min。产物于2%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳，100V恒压30min，紫外灯下观察结果。

    (2)PCR扩增产物的限制性内切酶消化  酶切体系为20μl，其中内切酶0.5μl，PCR产物5μl，缓冲液2μl ，去离子水12.5μl，37℃水浴4h。琼脂糖凝胶电泳及结果判定：3%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳，100V恒压50min，紫外灯下观察结果。IL?1B?31位点存在C→T的基因多态性现象，为Alu I 酶切位点，基因型?31C/C不被切开，只有239个为一个片段；?31C/T产生239bp、137bp和102bp三个片段；?31T/T产生137bp和102bp两个片段，见图2。IL?1B?511位点也存在C→T的基因多态性现象，为Ava I 酶切位点，基因?511C/C酶切后产生190bp和115bp两个片段；?511C/T产生305bp、190bp和115bp三个片段；?511T/T产生305bp一个片段，见图3。

    1.2.4  C→T突变和RFLP分析的可靠性证实

    随机挑选电泳图上显示的两种不同纯合子基因型的PCR产物送上海生工进行直接测序，见图4～7。

    1.3  统计方法

    采用SPSS11.0软件建立数据库，先各组各位点基因频率以及等位基因频率，在符合Hardy?Weinberg平衡后，通过χ2检验来进行组间比较，P<0.05差异有统计学意义。用比值比（OR）及95%可信区间（CI）表示相对风险度。

    2  结  果

    2.1  一般情况比较

    M：100bpDNA marker；1：C/C型；2：T/T型；3：C/T型

    图 2  IL?1B?31基因多态性电泳图

    M：100bpDNA marker；1：C/T型；2：C/C型；3：T/T型

    图 3  IL?1B?511基因多态性电泳图

    图4  IL?1B?31C/C基因型测序  图5  IL?1B?31T/T基因型测序

    图6  IL?1B?511C/C基因型测序  图7  IL?1B?511T/T基因型测序

    胃癌组和胃炎组在年龄、性别、HP阳性率等方面无统计学差异，见表1。表1  胃癌组和胃炎组一般情况比较

    基本特征胃癌组(n=52)胃炎组(n=55)人数(%)人数(%)P年龄≥50岁30(57.7)23(41.8)0.101<50岁22(42.3)32(58.2)性别男32(61.5)31(56.4)0.586女20(38.5)24(45.6)    HP阳性35(67.3)34(61.8)0.553阴性17(32.7)21(38.2)

    2.2  IL?1B?31位点和IL?1B?511位点基因型在胃癌组和对照组中频率分布及比较

    IL?1B?31T等位基因和IL?1B?31T/T基因型在胃癌组的分布频率要高于胃炎组(P<0.05),胃癌风险增加，OR值分别为1.97(95%CI=1.15～3.59)和2.71(95%CI=1.10～6.66)。IL-1B?511T等位基因和IL?1B?511T/T基因型在胃癌组的分布频率要高于胃炎组(P<0.05),胃癌风险增加，OR值分别为2.52(95%CI=1.45～4.39)和3.33(95%CI=1.14～9.73)，见表2。

    2.3  HP阳性个体IL?1B?31位点和IL?1B?511位点基因型在胃癌组和对照组中频率分布及比较

    在伴有HP感染的群体中进行比较，IL?1B?31位点各基因型未见明显差异。IL?1B?511T等位基因和IL?1B?511T/T基因型在胃癌组的分布频率要高于胃炎组(P＜0.05)，OR值分别为2.16(95%CI=1.10～4.23)和3.43(95%CI=1.01～11.62)。 表2  IL?1B?31位点和IL?1B?511位点基因型在胃癌组

　　　3  讨论

    胃癌的病因和危险因素很复杂，流行病学认为是环境因素和遗传因素综合作用的结果。近年来，在寻找潜在相关基因时，IL?1基因簇倍受关注，IL?1基因簇包括IL?1A、IL?1B和IL?1RN三个相关基因，定位于染色体2q13?q14，全长430kb，分别编码IL?1α、IL?1β和IL?1ra。IL?1β的生物活性是增强对表3  HP阳性个体IL?1B?31位点和IL?1B?511位点基因型在胃癌组和对照组中频率分布

    T等位基因=2×TT基因型人数+1×CT基因型人数外源性和内源性刺激的炎症应答，对胃肠道来说是一种重要的细胞因子，关于IL?1β在HP感染下间接诱导胃酸分泌减少过程中的作用，Takashima等[2]的研究提供了一个直接的证据。El?Omar等[3]报道在白种人胃癌病人一级亲属中IL?1B基因家族多态性（IL?1B?31C、IL?1B?511T和IL?1RN*2等位基因）合并胃酸分泌过少、幽门螺杆菌感染后胃癌危险性增高；在波兰人群的研究中发现，IL?1B?31C/?511T等位基因和IL?1RN2/2纯合子基因型使胃癌发生风险增加，其OR值分别为1.6(95%CI=1.2～2.2)和2.9(95%CI=1.9～4.4)。该发现随后被Machado等[4]在葡萄牙人群中的研究所证实。Ruzzo A等[5]在意大利人群中研究发现IL?1B?511T/T纯合子基因极大增加了胃癌的发病风险，OR值为3.2（95%CI=1.27～8.05）。Garza?Gonzalez E等[6]在墨西哥人群中调查研究IL?1B?31、IL?1RN基因多态性；在只对有HP感染的胃癌病例和对照组进行比较时，OR值为7.8(95%CI=1.05～161.8,P=0.04)。杨捷等[7]在对江苏金坛、淮安两地胃癌病人和对照者的研究中发现，在调整年龄、性别等因素后，携带?31TT基因型者比CC型胃癌发生的危险性增加75%；携带?511CC基因型者比TT型危险性增加63%,分层分析表明，这一危险性在HP感染人群中更为显著。然而，关于IL?1B基因多态性与胃癌发病风险的关系也存在着许多不同的研究结果。Gatti等[8]研究巴西北部人群发现IL?1B?31和IL?1B?511两个位点的多态性都与胃癌（包括肠型和弥散型）无关。韩国Chang等[9]研究IL?1B?511、IL?1B?31等几个位点基因多态性，结果发现在胃癌组和对照组的差别并无统计学意义。在中国Z?R Zeng等[10] 在胃癌高发地区陕西取86例胃癌病人和169例健康对照者与在低发地区广东取84例胃癌病人和192名健康对照者进行对比性研究。结果发现IL?1B?31C/C基因型频率在胃癌高发地区与胃癌发病风险相关，而在胃癌低发地区此基因频率与胃癌发病风险却是不相关的。以上研究表明IL?1B基因多态性在不同地域、不同种族之间可能存在着差异。

    本研究结果表明，携带IL?1B?31T和IL?1B?511T等位基因，尤其是IL?1B?31T/T和IL?1B?511T/T纯合子可能增加湖南衡阳地区胃癌发病的风险，在伴随HP感染时IL?1B?511T/T基因型可能为湖南衡阳地区胃癌的易感基因型。

【】
  /[1/] Yun?Lian T,Run?liang G,Bi?Hua D,et al.Detection and location of Helicobacter pylori in human ganstric carcinomas/[J/].World Gastroenterol,2005,11(9):1387?1391.

/[2/]Takashima M, Furuta T, Hanai H,et al.Effects of Helicobacter Pylori infection on gastric acid secretion and serum gastrin levels in Mongolian gerbils/[J/].Gut,2001,48（6）:765?773.

［3］ El?Omar EM, Carrington M, Chow WH,et al. The role of interleukin?1 polymorphisms in the pathogenesis of gastric cancer/[J/]. Nature,2001,412(6842):99.

/[4/] Machado JC, Pharoah P, Sousa S,et al.Interleukin 1B and Interleukin 1RN polymorphisms are associated with increase risk of gastric carcinoma/[J/]. Gsatroenteroloy,2001,121(4):823?829.

/[5/] Ruzzo A, Graziano F, Pizzagalli F,et al.Interleukin 1B gene (IL?1B) and interleukin 1 receptor antagonist gene (IL?1RN) polymorphisms in Helicobacter pylori?negative gastric cancer of intestinal and diffuse histotype/[J/]. Ann Oncol,2005,16(6):887?892.

/[6/]Garza?Gonzalez E, Bosques?Padilla FJ, El?omar EM,et al.Role of the polymorphic IL?1B, IL?1RN and TNF?A genes in distal gastric cancer in Mexico/[J/]. Int J Cancer,2005,114(2):237?241.

/[7/] 杨捷,胡志斌,徐耀初,等.IL?1B及IL?1RN基因多态性与胃癌易感性的关系/[J/].世界华人消化杂志,2004,12(8):1769?1773.

/[8/] Gatti LL, Burbano RR, de Assumpcao PP,et al.Interleukin?1beta polymorphisms,Helicobacter pylori infection in individuals from Northern Brazil with gastric adenocarcinoma/[J/].Clin Exp Med,2004,4(2):93?98.

/[9/] Chang YW, Jang JY,Kim NH,et al.Interleukin?1B (IL?1B) polymorphisms and gastric mucosal levels of IL?1beta cytokine in Korean patients with gastric cancer/[J/].Int J Cancer,2005,114(3):465?71.

/[10/]Zhi?Rong Z,Pin?Jing H,Sheng H,et al.Association of interleukin 1B gene polymorphism and gastric cancers in high and low prevalence regions in China/[J/].Gut,2003,52:1684?1689.