白藜芦醇抑制人脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡比较

         作者：常洪波,章翔,甄海宁,费舟,曹卫东

【摘要】  目的 探讨白藜芦醇（Resveratrol，Res）体外抑制U251、U87和SHG?44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的不同作用比较，验证Res确可导致U251细胞凋亡。方法 MTT比色法测量不同剂量的Res作用U251、U87和SHG?44胶质瘤细胞24h后对增殖的影响及不同剂量的Res作用U251、U87和SHG?44细胞6h、24h、48h后的影响。流式细胞仪用Annexin V?FITC和PI双染检测U251、U87和SHG?44细胞凋亡率。HE染色、Hoechst 33342荧光染色、透射电镜(TEM)观察U251细胞形态改变，流式细胞仪测定U251细胞的细胞周期改变。结果 Res明显抑制U251、U87和SHG?44细胞的生长和增殖（P＜0.01）且对U87细胞的抑制作用最强，U251和SHG?44细胞次之；对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应；Res所致的U251 、U87和SHG?44胶质瘤细胞凋亡为浓度依赖关系，且对U87细胞的凋亡作用强于U251和SHG?44细胞。U251凋亡细胞的细胞周期主要发生G1期阻滞。结论 Res对U251、U87和SHG?44细胞生长抑制及凋亡作用以U87细胞更明显，对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应并引起了其细胞周期改变。

【关键词】  白藜芦醇；胶质细胞瘤；细胞凋亡

　　Comparison Study on Resveratrol Suppressing Human Glioma Cells Growth and Inducing Apoptosis

　　Key words：Resveratrol； Glioma； Apoptosis

　　0  引言

    Res是一种多酚类化合物，化学名为3，5，4’?三羟基?反?均二苯代乙烯(3，5，4’?trihydroxystilbene, C14H12O3)，分子量228.2 [1]。近年来对其抗肿瘤作用研究较广泛。本研究旨在证明Res可抑制人源脑胶质瘤细胞系U251生长并导致其发生凋亡及细胞周期改变，探讨生长抑制与剂量、时间及凋亡与剂量的关系，并与Res抑制U87及SHG?44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的作用比较。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    Res购自Sigma公司，用DMSO溶解配成200 mmol/L贮存液-20℃冻存备用；U251、U87和SHG?44细胞系由本研究所提供；DMEM培养基购自Gibico公司；胎牛血清购自灏洋生物公司；MTT、Hoechst 33342荧光试剂盒、Annexin V?FITC和PI均为Sigma公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养 

　　U251、U87和SHG?44细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2孵箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　1.2.2  MTT法 

　　实验首先进行3种细胞Res处理24h的生长状态比较，取对数生长期U251、U87和SHG?44细胞，接种至96孔板内；实验按3种细胞分3组，每组将Res分7个不同浓度梯度，分别为5、25、50、100、200、300、400μmol／L的处理组及浓度为0μmol／L Res 的等量DMSO的对照组，每种浓度设6个重复孔，并以空白孔调零。各组细胞培养24h后，将培养液换成含不同浓度Res的培养液，继续培养24h，随后每孔加入20μl、5g/L的MTT，继续培养4h，最后每孔加150μl DMSO振荡10min，酶标分析仪检测490nm波长的光密度值(Optical density，OD)。其次按照同样方法进行Res处理U251、U87和SHG?44细胞6h、24h、48h的分组及其细胞生长状态的MTT法OD值测量。所得数据用SPSS 10.0软件均数及标准差，并进行方差分析，组间差异采用Dunnett?t 检验。

　　1.2.3  流式细胞仪检测细胞周期及Annexin V?FITC 和 PI双染检测细胞凋亡率 

　　消化收集200μmol/L Res处理24h的U251细胞及对照组细胞，调整细胞浓度1×106 /ml各取4ml，按常规细胞周期样品检测方法作程序性处理后进行流式细胞仪检测；分别消化收集300、150、50、5μmol/L Res处理24h组的U251、U87和SHG?44细胞和DMSO对照组的细胞，加入5μl Annexin V?FITC和5μl PI于细胞悬液中避光染色10min，流式细胞仪检测凋亡的百分比，数据用multicycle分析软件处理。

　　1.2.4  凋亡细胞的光镜观察 

　　将U251传代细胞接种于盖玻片表面，培养24h后，换成含200μmol/L Res的DMEM培养液，继续培养24h后，HE染色，光镜观察。

　　1.2.5  凋亡细胞的Hoechst 33342荧光检测

　　200μmol/L Res处理24h的U251细胞按荧光染色试剂盒方法逐步进行后荧光显微镜下摄片。

　　1.2.6  凋亡细胞的TEM观察 

　　消化收集200μmol/L Res处理24h的U251细胞，细胞计数1×106 ～107，1 500r/min离心15min后，4%戊二醛固定，按常规TEM样品作程序性处理，行TEM观察。

　　1.3  统计学分析

    采用SPSS10.0统计软件进行分析，计量资料结果采用(±s)表示，组间均数的比较用t 检验分析和方差分析。

　　2  结果
　　2.1  Res所致U251、U87和SHG?44细胞的细胞毒性效应比较

    通过设计的MTT实验，首先比较了Res对U251、U87和SHG?44细胞生长的抑制效果，见图1。随着Res作用浓度的增加、作用时间的延长，胶质瘤细胞受抑制作用越显著，从左到右的生长曲线分别为U87、U251和SHG?44细胞，可以看到U87细胞在同种浓度下的受到抑制更明显，存活率更低；MTT法分析存活率，当前存活率=同一浓度处理组OD值均值/DMSO对照组OD值均值×100%，设DMSO对照组存活率为100%。

　　其次Res作用6h、24h、48h后的U251、U87和SHG?44细胞的存活率见图2，Res引起的3种胶质瘤细胞生长抑制作用有浓度和时间的依赖关系，且有显著差异（P＜0.01）。

　　2.2  Res导致细胞凋亡的流式细胞仪分析

    经300μmol/L、150μmol/L、50μmol/L Res处理24h后和DMSO对照组的U87、SHG?44和U251细胞的凋亡率（包括早期及晚期凋亡）分别为52.2%、38.6%、24.4%、2.3%、40.5%、34.4%、22.7%、2.5%、43.8%、37.1%、23.3%、2.1%，有浓度依赖关系。3种细胞的凋亡率比较，可见不同浓度的Res作用后的凋亡率U87＞U251＞SHG?44，与MTT法测得的抑制率结果相一致。DMSO对照组及150μmol／L Res处理组的U251胶质瘤细胞的凋亡分布图，见图3A、B。U251的细胞周期改变， G1、G2、S期的细胞对照组分别占69.5%、2.7%、27.8%，200μmol/L Res处理组分别占76.4%、2.2%、21.4%。G1期比例升高，S、G2期比例降低，见图3C、D。

　　2.3  形态学结果

　　2.3.1  HE染色 

　　光镜下观察所见U251凋亡细胞，细胞变圆、细胞核固缩、深染，核染色质致密，形状不一、大小不等的团块边集于核膜。

　　2.3.2  Hoechest 33342染色
 
　　U251凋亡细胞的荧光染色高倍镜下观察结果，可见凋亡细胞，细胞核固缩，核染色质边集，荧光信号强，见图4。

　　2.3.3  透射电镜观察 

　　凋亡的U251细胞表面绒毛消失，表面光滑，细胞膜表面有出泡现象，线粒体崩解，胞质浓缩，染色质晚期碎裂，边集。

　　3  讨论

    Res是普遍存在于葡萄属植物中的一种物质，是一种多酚类化合物，已在72种植物中被发现。对Res药理作用的认识最早源自其具有抗脂质过氧化作用。近年对Res抗肿瘤活性机制的研究揭示，其在肿瘤启动、促进及3个阶段都有抗肿瘤功效。目前提出的Res抗肿瘤途径有很多种，但机制还不是很清楚。本实验证实Res对U251肿瘤细胞的抑制率大于凋亡率更大于死亡率，说明Res导致凋亡作用不是唯一途径。我们主要对Res导致U251细胞凋亡及引起其细胞周期改变进行研究，证实Res阻滞U251胶质瘤细胞的细胞周期从G0/G1期进入S期，导致了S期减少，并且根据报道Res可通过抑制人脑胶质瘤U251细胞 [2]、人乳腺癌MCF?7细胞 [3]的细胞周期蛋白cyclin D1表达，导致细胞周期G0/G1阻滞，并应用周期素依赖性蛋白激酶抑制剂可以抑制Res导致的凋亡 [2]，由此考虑细胞周期的阻滞可能促进了Res导致的凋亡性死亡，引起了肿瘤细胞生长抑制，但是其确切的作用机制还有待我们深入的研究。

    本研究证明Res对U251胶质瘤细胞的生长抑制呈浓度和时间依赖关系，这与我们以前对SHG?44 [4]、U87 [5]细胞的实验结果一致，也与文献对RT?2胶质瘤 [6]、乳腺癌 [3]、前列腺癌 [7]等的报道结果一致。同时，我们也证明了Res对人源U251、U87和SHG?44胶质瘤细胞产生明显的凋亡作用，与其引起其他肿瘤细胞发生凋亡 [6，8]的结果有相似性，都有浓度依赖关系。本实验又证实Res对U251、U87和SHG?44细胞生长抑制及凋亡作用以U87细胞最明显，这样我们以后可以采用更为敏感的U87细胞进行机制研究及动物实验。另外，实验中用于溶解Res的溶剂为稀释至1‰的DMSO溶液，对细胞不具有毒性作用，Res对正常细胞及3T3成纤维细胞没有明显毒性作用 [6，8]。

    以上实验证明了Res确可抑制人源U251胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡，并筛选出了对Res更为敏感的U87细胞作为以后机制研究的细胞系。我们认为加强Res的抗癌耙点研究，可以为临床开发新药物提供理论依据。同时我们认为Res作为一种天然药物比传统化疗药物有优势，有着很好的应用前景。（本文图4见第318页）

【文献】
  　　［1］Soleas GJ, Diamandis EP, Goldberg DM . Resveratrol: a molecule whose time has come and gone？ [J].Clin Biochem, 1997, 30(2): 91?113.

　　 [2] Jiang H, Zhang LJ, Kuo J, et al. Resveratrol?induced apoptotic death in human U251 glioma cells [J]. Mol Cancer Ther, 2005, 4(4): 554?561.

　　 [3] Kim YA, Choi BT, Lee YT, et al. Resveratrol inhibits cell proliferation and induces apoptosis of human breast carcinoma MCF?7 cells [J]. Oncol Rep，2004, 11(2): 441?446.

　　 [4] 常洪波，章翔，甄海宁，等.白藜芦醇抑制SHG?44胶质瘤细胞生长实验研究 [J].中华神经外科疾病研究杂志，2006，5(2)：119?123.

　　 [5] 常洪波，章翔，甄海宁，等.白藜芦醇诱导U87胶质瘤细胞凋亡及caspase?3的激活 [J].中华神经医学杂志，2006，5(4)：333?337.

　　 [6] Tseng SH, Lin SM, Chen JC, et al. Resveratrol suppresses the angiogenesis and tumor growth of gliomas in rats [J]. Clin Cancer Res，2004, 10(6):2190?2202.

　　 [7] Hsieh TC, Wu JM. Differential effects on growth, cell cycle arrest, and induction of apoptosis by resveratrol in human prostate cancer cell lines [J]. Exp Cell Res，1999，249(1):109?115.

　　 [8] 章薇，费舟，章翔，等. 白藜芦醇抑制胶质瘤细胞生长与诱导细胞凋亡实验研究 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志，2004，3(5)：401?405.