Na+,K+-ATP酶β1亚基与肿瘤细胞生长相关性
作者:熊竹娟 林苹 张洁 王修杰 王琪 任婧婧 杨洪亮 王静 吴亚英
【摘要】 [目的] 探讨Na+,K+-ATP酶β1亚基(ATP1B1)与肿瘤细胞增殖分化的关系,以及外源性ATP1B1对肿瘤细胞的影响。[方法] 采用RT-PCR检测肿瘤细胞株、正常外周血单核细胞中ATP1B1的mRNA水平,以及经脂多糖(LPS)促进细胞增殖、二甲亚砜(DMSO)诱导肿瘤细胞分化后ATP1B1的mRNA水平变化,并观察通过转染技术增加肿瘤细胞中ATP1B1表达后细胞的生长情况。[结果] 肿瘤细胞株中ATP1B1的mRNA水平明显高于正常单核细胞(P<0.05),促进细胞增殖后细胞中ATP1B1的mRNA水平增高(P<0.05),诱导分化后降低(P<0.05),导入外源性ATP1B1 使肿瘤细胞增殖明显受抑(P<0.05)。[结论] Na+,K+-ATP酶β1亚基可以成为反映细胞功能状态特别是肿瘤细胞增殖代谢的重要指标,为肿瘤生物的新策略提供重要的实验依据。
【关键词】 Na+ K+-ATP酶β1亚基 肿瘤细胞 增殖 诱导分化
Abstract: [Purpose] To explore the relationship between Na+,K+-ATPase β1-Subunit (ATP1B1) and tumor cell in proliferation and differentiation, as well as the effect of ATP1B1 introduction.[Methods] The levels of ATP1B1 mRNA were detected by RT-PCR in both of tumor cell lines and normal peripheral blood monocyte, and the changing of ATP1B1 mRNA were analyzed in the proliferation-cells stimulated by LPS and the differentiation-cells induced by DMSO. Moreover, survival of cells transfected with ATP1B1 was observed. [Results]The expression of ATP1B1 mRNA in tumor cell was significantly higher than that of normal monocyte(P<0.05). ATP1B1 mRNA level was enhanced in tumor cell lines and monocytes by LPS stimulation(P<0.05), while the level of ATP1B1 mRNA of these cells were decreased by DMSO-induced differentiation(P<0.05). The growth of the tumor cells transfected with ATP1B1 was inhibited obviously(P<0.05). [Conclusion] ATP1B1 can be the index of cell functional status, especially tumor cell proliferation and differentiation. It will become an important experiment foundation for the biotherapy of tumor.
Key words: Na+,K+-ATPase β1-subunit; tumor cell; proliferation; differentiation
Na+,K+-ATP酶是一种广泛存在于真核生物细胞上的跨膜转运蛋白,主要调节细胞内外Na+、K+的平衡,维持细胞的容积和保证细胞内环境的稳定。Na+,K+-ATP酶可能与肿瘤的转移有关,已有将其作为治疗乳腺癌靶点的研究[1]。有关Na+,K+-ATP酶与细胞功能关系的研究逐渐成为关注热点,目前α亚基的研究较多,而对Na+,K+-ATP酶的调控亚基——β亚基的研究较少。我们检测了多种细胞的Na+,K+-ATP酶基因表达情况,发现正常外周血单核细胞与肿瘤细胞株间的ATP1B1 mRNA表达有着显著的差异性,而细胞增殖和细胞分化后ATP1B1基因表达又有变化,向细胞中导入ATP1B1有着明显的抑制细胞增殖效应。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司,RT-PCR一步法试剂盒及PCR引物自TaKaRa公司购买和合成。ATP1B1真核表达载体ATP1B1-CMV-flag及载体pFLAGCMV-1由日本国立长寿研究中心中岛副教授惠赠,人胃腺癌SGC7901细胞、 肝癌SMMC7721细胞、肺腺癌SPC-A-1细胞、脑胶质瘤U251细胞、乳腺癌MCF-7细胞、单核细胞白血病THP-1细胞、急性早幼粒白血病NB4细胞、白血病Jurkat细胞、慢性髓系白血病K562细胞由本室常规培养、保存,MTT购自Sigma公司, 脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogene公司。
1.2 肿瘤细胞株与正常人外周血单核细胞中ATP1B1基因的表达
收集细胞株SGC7901、SMMC7721、MCF-7、U251、SPC-A-1、THP-1、NB4、Jurkat、K562以及正常人外周血单核细胞,按RNA抽提试剂盒说明提取细胞总RNA,采用一步法进行逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)测定ATP1B1 mRNA的表达。设计的引物为:上游引物:5′-GCCAGGATTAACACAGATTCCTCAG-3′,下游引物:5′-CCTTATCTTCATCTCGCT-
TGCC-3′;内参照物β-actin:上游引物:5′-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3′,下游引物:5′-GTGAT-
CTCCTTCTGCATCCTGT-3′。反应条件为:50℃ 15min,94℃ 2min,(94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 1min)25个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察。
1.3 细胞在增殖过程中ATP1B1基因的表达
分别将肿瘤细胞株K562、Jurkat、正常人外周血单核细胞用LPS(200ng/ml)刺激培养24h后计数并收集,提取细胞总RNA并进行RT-PCR检测ATP1B1基因表达情况,Quantity One4.5.0软件分析mRNA水平变化, 按公式mRNA表达水平:mRNA水平=目的基因面积值/内参面积值。
1.4 诱导分化肿瘤细胞株的ATP1B1基因的表达
将SMMC7721、Jurkat、SPC-A-1细胞按1×105接种于6孔板,用含1.25%DMSO(实验组)或不含DMSO(对照组)的10%小牛血清的RPMI 1640培养,5d后收集细胞,计数后提取细胞总RNA并进行RT-PCR。 Quantity One4.5.0软件分析mRNA水平变化。
1.5 ATP1B1-CMV-flag转染SMMC7721细胞
取对数生长期SMMC7721细胞3×103接种于96孔板,50%融合时进行转染。分别取ATP1B1-CMV-flag 以及空载体pFLAGCMV-1 DNA50ng/孔、100ng/孔、150ng/孔、200ng/孔、250ng/孔、300ng/孔,脂质体Lipofectamine 2000(0.3μg/孔)按常规方法进行转染。并以转染脂质体(0.3μg/孔)作为对照,未转染的细胞作为空白对照,每组设3个复孔。
1.6 转染后细胞体外培养生物学行为观察
在光学倒置显微镜下观察其形态变化。经转染的细胞37℃、5%CO2、饱和湿度培养72h后,常规MTT法测定各孔吸光度值(A值),细胞抑制率(%)=(1-实验组A值/空白对照组A值)×100%。
1.7 统计学处理
数据采用SPSS 10 for Windows软件分析处理,转染结果进行单因素方差分析,细胞增殖分化实验组与对照组采用t检验。
2 结 果
2.1 肿瘤细胞株中ATP1B1基因mRNA表达
分别测定实体肿瘤细胞株SGC7901、SMMC7721、U251、MCF-7、SPC-A-1,血液肿瘤细胞株K562、NB4、Jurkat、THP-1和正常人单核细胞的ATP1B1基因mRNA,在肿瘤细胞株可见到422bp的扩增条带,与设计的扩增片段大小相符,细胞株间ATP1B1基因表达强度有一定的差异,而正常人单核细胞均未见阳性条带。
2.2 在增殖过程中ATP1B1基因mRNA表达增高
采用LPS刺激肿瘤细胞株K562、Jurkat及正常单核细胞增殖,RT-PCR结果显示:经刺激增殖的细胞中ATP1B1基因mRNA表达均较无刺激的增强,其中K562细胞最明显(242.15%±2.39%),单核细胞(180.42%±3.47%)和Jurkat细胞(133.64%±3.01%)刺激增殖后ATP1B1基因mRNA 略有增高,各LPS刺激组和无LPS组间的差异均有统计学意义 (P<0.05)。
2.3 诱导分化后细胞ATP1β1基因mRNA表达降低
肿瘤细胞株SMMC7721、Jurkat、SPC-A-1经DMSO诱导分化后检测ATP1β1基因表达量,结果显示SMMC7721、SPC-A-1细胞ATP1B1mRNA表达量较未经诱导分化的减少,抑制率分别为28.99%±0.25%、65.81%±0.58%(P<0.05),Jurkat细胞减少不明显(1.53%±0.95%)(P>0.05)。
2.4 转染后细胞体外培养生物学行为观察
2.4.1 一般形态学
SMMC7721转染表达质粒ATP1B1-CMV-flag组细胞变化显著。细胞增殖明显受抑,50ng/孔开始细胞即有大量皱缩变小变圆,其它细胞胞浆中出现细小空泡,细胞呈中间膨大四周细长的梭型或多边行。转染pFLAGCMV-1或脂质体的细胞增殖较空白组稍少,胞浆中有少量空泡。空白组细胞增殖好,形态正常,细胞伸展相互连接。
2.4.2 MTT法检测细胞抑制情况
转染ATP1B1-CMV-flag组对SMMC7721细胞的生长有明显的抑制作用,从50ng/孔~350ng/孔抑制率分别为42.39%±0.67%、43.68%±1.13%、45.69%±0.33%、50.04%±0.94%、49.56%±0.71%、47.51%±0.47%、50.43%±1.69%,对应的pFLAGCMV-1组对细胞生长的抑制率分别为2.43%±0.56%、8.23%±0.88%、8.36%±0.95%、10.20%±1.01%、11.66%±0.82%、12.32%±0.87%、17.08%±1.72%。各转染相同DNA浓度的ATP1B1-CMV-flag组与pFLAGCMV-1组对细胞生长的抑制效应有显著差异性(P<0.05),见图1。
3 讨 论
Na+,K+-ATP酶主要由α亚基和β亚基构成,α亚基是催化亚基,调节亚基β是Na+,K+-ATP酶极化分布的关键因子[2]。在哺乳动物中β亚基有3个亚型:β1、β2、β3,β1最普遍[3],位于细胞膜上[2~4],各亚型的功能还不十分清楚。β亚基可能在全酶结构和功能的成熟、调节酶对阳离子的亲和性以及将α亚基传送到胞膜中发挥作用[2,5~7]。Beguin等[8]指出β亚基可以防止α亚基在内质网中的降解。
本实验通过RT-PCR检测到肿瘤细胞株ATP1B1基因表达量普遍高,而正常成人单核细胞中表达低。这可能与肿瘤细胞生物学特性有关,即增殖能力强,代谢旺盛,则Na+,K+-ATP酶含量增多或功能增强,随之ATP1B1基因表达量也有所增高。为证实这一推论,我们进一步检测ATP1B1基因表达量的变化。实验结果表明在LPS刺激细胞处于增殖旺盛状态下,ATP1B1基因表达量增高;而利用DMSO减慢细胞增殖速度、加强分化后ATP1B1基因表达量降低。从而证实了ATP1B1基因表达量与细胞增殖、代谢的关系,即细胞增殖快时ATP1B1基因表达量增高,反之降低。而对DMSO作用不敏感的Jurkat细胞,在DMSO诱导后其ATP1B1mRNA改变的程度较小,也说明了ATP1B1基因表达量的变化可以反映细胞增殖状态和活性。
我们转染ATP1B1表达质粒于肿瘤细胞,实验表明增加ATP1B1在肿瘤细胞中的表达能够显著抑制肿瘤细胞的生长,甚至使其变性死亡。导入空载体不会明显出现该现象,这可能与增加ATP1B1表达能增强ATP酶活性有关。Liora等将ATP1B1转染到CHO细胞中可以上调内源性α亚基的表达,使α亚基到达细胞表面[5];Rajasekaran等也指出哺乳动物细胞中β1亚基可以促进α1亚基 mRNA的翻译,增加内质网中α1亚基的合成,导致α1β1复合物的增加,以及Na+,K+-ATP酶活性的增强。说明在细胞中增加外源性ATP1B1的表达会影响Na+,K+-ATP酶活性,伴随Na+,K+等离子交换加强,促使细胞内外离子浓度的失衡,导致细胞内环境的混乱,引起细胞一系列的变化。
但由于增加ATP1B1-脂质体复合体的转染量势必加大脂质体的浓度(脂质体本身也是细胞生长的影响因素),我们的实验中0.3μg/孔的脂质体对细胞增殖影响小而又能和足量的ATP1B1结合发挥作用,这样就存在复合体结合的饱和问题,所以我们在实验中观察到当ATP1B1的量增加到一定程度对细胞生长的改变将趋于稳定。
本文从一定程度上证明了该亚基能反映细胞功能状态,特别是肿瘤细胞的增殖代谢情况,从而为临床上判断肿瘤的恶性程度以及肿瘤的早期诊断提供一定的实验依据。
【】
[1] Chen JQ, Contreras RG, Wang R, et al. Sodium/potasium ATPase (Na(+), K (+)-ATPase) and ouabain/related cardiac glycosides: a new paradigm for development of anti-breast cancer drugs?[J]. Breast Cancer Res Treat,2006, 96(1):1-15.
[2] Shoshani L, Contreras RG, Roldan ML, et al. The polarized expression of Na+, K+-ATPase in epithelia depends on the association between beta-subunits located in neighboring cells[J]. Mol Biol Cell, 2005, 16(3):1071-1081.
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