循环肿瘤细胞的研究进展
【摘要】 肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成临床转移灶提供了可能。深入研究循环肿瘤细胞有助于对肿瘤转移机制的了解，可为抗转移提供依据。全文综述循环肿瘤细胞的临床意义及检测方法。
【关键词】 血液循环 肿瘤循环细胞 肿瘤转移
（The Fourth Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China）Abstract: Cancer cell exfoliation, invasion and entry into circulation system is the early event with metastasis, which provide the possibility to formation of clinical metastase. Further research about the circulating cancer cells can help us to understand the mechanism of metastasis and offer the scientific proof against anti?鄄metastasis. The clinical significance and detection of circulating tumor cells were reviewed.
Key words: blood circulation; neoplasm circulating cells; neoplasms metastasis 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对肿瘤转移机制研究的深入，尤其是伴随检测技术的广泛应用，CTC逐渐被人们所重视。本文就其研究进展作一综述。
1 概 述
CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖,部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质,增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。Louha等[2]报道，在肝癌患者手术中牵动肝脏易发生医源性肿瘤细胞扩散，其原因可能是肝脏具有海绵状结构，牵动肝脏可使器官伸展和压缩。
进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡。宿主的免疫识别和机械杀伤作用以及肿瘤细胞自身因素，如缺乏变形性以致不能顺利通过循环管道系统，或缺乏形成癌栓能力等均可导致肿瘤细胞死亡。只有极少数具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下为转移灶。因此，在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移。
2 临床意义
2.1 CTC与肿瘤转移
研究认为，自发和（或）由外科操作进入血循环的肿瘤细胞可以单个或簇状种植和贴附在其它组织，以休眠状态蜇伏其中，等待某一激活剂唤醒，一旦获得活力或在其它因素的影响下，它们便开始增殖，通常会迁移到更适于增殖的新的器官[3,4]。因此推测，临床观察到的经成功切除原发灶一段时间后患者发生其它器官转移的现象，如肝移植治疗肝癌后在移植肝或自体肺中复发；眼黑色素瘤切除后患者可在术后２０年发生肝转移，可能由CTC引发。Luzzi等[3]应用小鼠体内模型研究黑色素瘤细胞的转移潜能，证明渗出的处于休眠状态的肿瘤细胞与形成早期微转移之间的比率很高。休眠细胞增殖和凋亡率很低，仅2％~3％。休眠细胞如何保持休眠状态并在一段时间后产生恶性效应的确切机制目前尚不清楚。普遍认为肿瘤细胞长期保持休眠状态主要依赖于肿瘤血管形成缺如和机体正常的免疫功能状态。研究提示，未能形成转移的另一关键因素是休眠细胞未能得到适宜的激发；细胞因子、生长因子、激素和细胞外基质等微环境因素均参与调节肿瘤细胞休眠后的增殖。
2.2 CTC与临床分期
是否存在远处转移是临床分期的判断标准之一，虽然血液中检测到肿瘤细胞并不意味着必定形成转移灶，但是研究表明，CTC的存在与肿瘤分期具有明显的相关性。Kim等[5]研究可手术的和转移性乳腺癌患者外周血中的癌细胞，发现CTC在早期能手术的乳腺癌患者中是罕见的，但在转移性乳腺癌的患者中很多。高纪东等[６]应用流式细胞仪定量检测乳腺癌患者手术前后CTC数量，结果显示其与病理分期及脉管瘤栓均有明显的相关性。分子生物学技术的发展，使通过检测实体瘤患者外周血肿瘤相关基因，借以分析CTC的存在成为可能。Kurusu等[7]通过检测103例非小细胞肺癌患者外周血中的肿瘤组织特异性CEAmRNA，发现阳性率很大程度上与术前术后的疾病分期有关。李地芬等[8]研究结果显示随着肿瘤分期的增高，结直肠癌患者外周血中的CEAmRNA检出率亦增高。Zsolt等[9]检测前列腺癌患者血液中PSAmRNA及PSMAmRNA的表达，发现阳性率亦随肿瘤分期的增高而增加。目前尚未证实CTC水平可被用作判断分期的标准检测，然而它确能有助于改善肿瘤分期，从而提高临床医生的警惕性，以便采取更加积极的治疗。
2.3 CTC与个体化治疗
当前对恶性肿瘤的治疗是基于肿瘤大小、病理分级、淋巴结及远处转移、病人一般状况及肿瘤发展趋势等因素之上的综合治疗。但遵循统一的诊断标准建立的治疗方案缺乏个体化。随着对CTC研究的深入，人们发现检测CTC有助于建立个体化的治疗方案。Beitsch等[10]采用流式细胞计数、免疫化学等方法比较早期及晚期乳腺癌患者CTC的水平，明确发现转移性乳腺癌比早期乳腺癌有更多的CTC。通过这种方法能够筛选出高危患者，决定是否需要辅助治疗。Bela等[11]研究认为，CTC数量的改变可以反应肿瘤对治疗的敏感性及其增殖活性，可为个体化治疗提供依据。最近，Cristofanilli等[12]检测117例进展期乳腺癌患者CTC在治疗前后的变化情况,发现CTC水平可以预测进展期乳腺癌的治疗效果。CTC水平在治疗前较低或开始治疗之后降低的女性治疗效果好，而在治疗后CTC水平仍较高的患者与前者相比,疾病进展迅速，生存期短，治疗效果差。传统的临床评定疗效方法是根据肿瘤的大小变化，需要在开始治疗之后3~4个月进行，而且需要进行一系列检查如ECT、X线等。而Cristofanilli等的研究显示通过检测转移性乳腺癌患者CTC水平可以在最初治疗之后3～4周尽早预测疗效。这对于决定患者的个体化治疗具有重要意义。已有研究表明检测早期乳腺癌患者骨髓微转移情况可以监测辅助治疗效果[13,14]，而在考虑给予辅助治疗的问题上，CTC在转移性乳腺癌中的重要作用可能与骨髓微转移在早期乳腺癌中的作用类似。目前有学者正研究能否根据CTC水平改变治疗方案藉以提高疗效,如根据其检测结果，结合病人的具体情况选择适宜的辅助治疗，调整治疗强度、持续时间，尽量使病人免受不必要的毒性作用。
2.4 CTC与预后
肿瘤患者的预后与多种因素有关。目前众多的研究提示存在CTC的患者预后较差。Kurusu等[7]研究发现许多能手术的非小细胞肺癌患者术后外周血中若发现肿瘤特异性CEAmRNA提示这些患者可能复发率很高，预后欠佳。Miyazono等[15]检测57例胃癌患者手术前后外周血中CEAmRNA，也发现术后CEAmRNA阳性的病例复发率高。Baba等[16]研究子宫癌患者外周血中肿瘤特异性β酪氨酸相似蛋白（BCLPmRNA）的表达发现在复发患者中敏感性为87.5％，特异性为50.0％。Bilchik等[17]研究认为检测结肠癌患者的CTC有助于预测预后，CTC阳性可作为复发的早期征象。一些资料表明，采用大剂量化疗联合自体干细胞移植治疗高危乳腺癌患者时，CTC可随自体移植物被回输因而导致肿瘤的复发。Cristofanilli等[12]研究发现每7.5ml外周血中CTC>5个的进展期乳腺癌患者治疗后缓解期<3个月，总生存期约10个月，而CTC<5个的患者缓解期可达7个月，总生存期超过18个月。提示在转移性乳腺癌患者中，治疗之前CTC的数量是一个独立的预后指标。
3 检测方法
3.1 免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）
这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK），如CK?鄄19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA?鄄125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG），如TAG?鄄12。1980年，Sloane等[18]首次采用ICC的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,故特异性不高。Braun等[19]认为由于CTC不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC检测的特异性。
3.2 多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）
该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生的DNA异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR技术检测CTC受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant?鄄allelie specific amplification, MASA）的PCR技术，检测大肠癌和胰腺癌患者外周血中具有K?鄄ras癌基因突变的肿瘤细胞。
3.3 逆转录聚合酶链反应（RT?鄄PCR）
这种方法在PCR的基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片断。RNA检测的特异性靶mRNA有：①某些基因改变后RNA水平的异常，如点突变（p53、ras）、缺失（BRCA1、BRCA2）、异构（CD44）、扩增（erb?鄄B2、EGFR）；②组织特异性标志mRNA,如mucin、cytokeratin、ER、maspin；③肿瘤特异性标志mRNA，如CEA、β?鄄HCG等[20]。1991年Smith等[21]首先将RT?鄄PCR应用于外周血黑色素瘤细胞的检测。此后，这一技术已分别在多种恶性实体瘤中得以应用，如对消化系统肿瘤作CEAmRNA检测[22]，对乳腺癌作MAMmRNA检测[23]，对肝癌作AFPmRNA检测[24]，对前列腺癌作PSAmRNA检测[25]等。RT?鄄PCR方法具有高度的敏感性和特异性，其敏感性可达10－6~10－7，特异性在于其扩增模板为mRNA：RNA在细胞外环境中极不稳定，一旦检测到特异性mRNA的表达就意味着有肿瘤细胞的存在；mRNA的表达不受相应编码蛋白表达高低的影响；引物的设计可以跨越两个不同的外显子，避免了整个基因组的扩增，有利于消除假阳性结果。由于RNA易被RNA酶降解，同时该方法具有PCR技术的局限性，仍可出现假阳性和假阴性结果。为提高RT?鄄PCR的特异性和敏感性，新的方法不断产生，在RT?鄄PCR的基础上又增加了定量逆转录多聚酶链反应（QPCR）,荧光定量逆转录多聚酶链反应（FQ?鄄PCR）等。
3.4 流式细胞术（flow cytometry, FCM）
该技术是以流式细胞仪为工具对悬液中的细胞进行测量分析，具有快速、准确的优点，其筛选细胞的速度为103~104个细胞/s。应用FCM从血液中检测上皮性肿瘤细胞其价值很大程度上依赖于可分析的细胞数量[26]。尽管FCM不能提供有关细胞形态方面的信息，但是,其在鉴定、计数肿瘤细胞方面比RT?鄄PCR更可靠。Irene等[27]研究证明FCM可作为一种检测CTC数量的有力工具。现有的FCM需取大约50ml外周血方可检测肿瘤细胞负荷，若检测前进行特异性富集肿瘤细胞，将在很大程度上提高检测的敏感性。
3.5 其 它
目前，CTC检测方法较多，但检出率仍有限，一些明确存在转移灶的患者CTC阳性率可能很低。导致这一情况的原因可能是不了解肿瘤细胞释放的（CTC的释放可能是间歇性的），且循环中的肿瘤细胞常常成群，单点时间的检测可产生一定的偏倚，而实际表达可能更高。连续多次取样或加大样本量可能会提高检出率。再者，检测方法本身也都存在一定的局限性，可能出现假阳性与假阴性。在设立对照，均衡、优化实验条件的同时，可选用免疫磁性分离技术即磁性激活的细胞筛选（magnetic?鄄activated cell separation，MACS）富集肿瘤细胞、激光扫描细胞计数器等来提高检测的敏感性和特异性。Vona等[28]根据上皮肿瘤细胞的大小建立了一种简便、的分离计数CTC的方法，即利用上皮肿瘤细胞比外周血细胞大的特点，通过过滤使之得到分离、富集。该方法敏感度高，1ml血中有1个肿瘤细胞也可检出，适用于多种类型的肿瘤。已有研究表明，在肝癌患者外周血肿瘤细胞的收集方面，该方法的敏感性比RT?鄄PCR方法更高，若与其它方法联合应用可显著提高检测效率和准确性。
4 结 语
通过分析CTC的生物学特征，有助于提高人们对肿瘤转移规律的认识。研究表明，CTC的出现可作为一个独立的预后因素，并与无复发生存有关。早期准确地检测CTC对合理地进行综合至关重要，并可作为肿瘤疗效评估指标及加强辅助化疗的选择性指标，有助于建立个体化治疗方案，从而降低肿瘤复发率，延长患者生存期，使肿瘤的综合治疗更加及时、完善、有效。
随着分子生物学技术的，CTC检测方法的敏感性和特异性将不断提高，特别是与细胞富集技术的结合更有助于早期CTC的发现。目前在单个CTC水平进行基因组及mRNA表达谱的分析，将有助于提高人们对CTC本质的认识，还可通过体外培养CTC进行基础研究，以期为肿瘤治疗提供新的理论依据。总之，检测CTC有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。
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