外源性bFGF对鸡形觉剥夺性近视眼球后壁组织中VIP表达的影响
【摘要】 目的: 观察外源性bFGF（basic fibroblast growth factor）对雏鸡形觉剥夺性近视眼（form deprivation myopia, FDM）眼球后壁组织血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）表达的影响。 方法: 将出生2d龄的40只来亨雏鸡随机分为对照组和实验组，两组右眼为遮盖眼，左眼为自身对照眼。对照组遮盖眼注射1g/L牛血清白蛋白（bovine scrum albumin, BSA）溶液20μL，共10只鸡；实验组遮盖眼玻璃体腔注射bFGF 1，2，4ng+1g/L BSA溶液20μL，每种剂量10只鸡。1wk后采用SP法免疫组织化学染色和逆转录聚合酶链反应检测眼球后壁组织VIP的表达。所有实验数据，对照组和实验组比较采用单因素方差分析，不同浓度实验组间采用SNK-q 检验。 结果: VIP的表达主要位于视网膜光感受器外节、内核层、内丛状层和脉络膜，在神经节细胞层和神经纤维层有较弱表达。所有组自身对照眼的VIP表达两两比较均无明显差异（P ＞0.05）；实验组与对照组遮盖眼相比较差别有统计学意义，VIP表达在实验组明显上调（P ＜0.01)，并且VIP的表达在实验组组间的差别有统计学意义，随药物剂量增加有逐渐上调的趋势（P ＜0.05）。 结论: 外源性bFGF可上调鸡FDM眼球后壁组织VIP的表达。
【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子 血管活性肠肽 形觉剥夺眼 外源性
The effect of exogenous bFGF on the expression of vasoactive intestinal peptide in form deprivation myopia of chick
Abstract AIM: To investigate the exogenous basic fibroblast growth factor (bFGF) as a regulator on the expression of vasoactive intestinal peptide (VIP) on form deprivation myopia (FDM) of chick retinal-choroids-sclera.METHODS: Forty two-day-old lehorn chickens were divided randomly into control group and experimental group. The right eyes of the chickens were covered and the left eyes served as the auto control eyes. The covered eyes of the control group received 20μL 1g/L bovine scrum albumin (BSA), 10 chickens aggregated. The covered eyes of the experimental group received bFGF (1, 2, 4ng)+20μL 1g/L BSA, with each dosage on 10 chickens. The eyes in the two groups were continually covered for 1 week. The expression of VIP on retinal-choroids-sclera was investigate by streptavidin-peroxidase (SP) immunohistochemistry staining and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The data were analyzed by analysis of variance (ANOVA) between the control group and experimental group and by analysis of SNK-q among each dosage in the experimental group.RESULTS: VIP widespread expression existed on photoreceptor-outer, inner nuclear layer, inner plexiform layer of retinal and choroids; weak expression existed on ganglion cell layer and nerve fiber layer. The expression of mRNA of VIP in auto control eyes between groups was not statistically significant (P＞0.05). In comparison with the covered eyes of control group, the expression of mRNA of VIP in experimental group were significant up-regulated (P＜0.01) , showing a dose-dependent manner (P＜0.05). CONCLUSION: Exogenous bFGF could up-regulate the expression of VIP on retinal-choroids-sclera which may play an antagonistic action in ocular enlargement of chicken FDM.
· KEYWORDS: basic fibroblast growth factor; vasoactive intestinal peptide; form deprivation myopia; exogenous
Liu SZ, Jiang JJ, Wang H. The effect of exogenous bFGF on the expression of vasoactive intestinal peptide in form deprivation myopia of chick. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2007;7(2):406-408
0引言
近视的发病机制复杂，因此制约了近视眼的病因学。近年来通过对实验性近视的研究发现眼内生物活性物质对眼球的生长起重要的调控作用，其中细胞因子、神经递质、激素、视黄酸都证实与近视的发生、有密切的关系。但是随着越来越多近视信使的发现与研究，也揭示了近视的发病机制不是一个简单的单通路信号传导过程，而是一个多种近视信使介导的多通路信号传导过程，诸多因素间存在着复杂的调控机制，因此深入了解各种近视信使之间的相互作用，是否存在协同或抑制作用，将有助于阐明近视的发病机制，并找到有效的治疗手段。碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor , bFGF）和血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）分属不同类型的近视信使，我们通过外源性bFGF来观察其对鸡形觉剥夺性近视眼球后壁组织中VIP表达的影响。
1材料和方法
1.1材料 健康2d来亨雏鸡（湖南农业研究院畜牧研究所原种鸡场提供），雌雄兼用，在购买当日，40只雏鸡右眼均使用10mL塑料试管底制成的眼罩遮盖，左眼为未遮盖眼，作为自身对照眼。在12h∶12h的昼夜节律下进行普通饲养，饲养的动物室通风，室温保持在28～32℃,水和食物随意。分别向遮盖眼玻璃体腔注射药物20μL，均以牛血清白蛋白（bovine scrum albumin, BSA）作为载体，BSA浓度为1g/L。随机将这40只雏鸡分为对照组（玻璃体腔注射1g/L BSA溶液20μL）和3种剂量梯度的bFGF实验组（玻璃体腔注射bFGF 1，2，4ng+1g/L BSA溶液20μL）。bFGF (美国Protech公司)，BSA(美国Sigma公司），兔抗人VIP多克隆抗体工作液及SP-9001免疫组化试剂盒（美国ZYMED公司），trizol、逆转录试剂盒、PCR试剂盒（美国Fermentas公司）。
1.2方法 雏鸡饲养1wk后，摘去眼罩，在深麻醉的状态下断颈，无菌快速摘除双侧眼球，将眼球沿赤道部切开，去除玻璃体，取眼球后壁组织切开一半放入标记好的EP管中，于液氮中速冻10s，然后转入-70℃深低温冰箱中保存。剩下一半眼球后壁组织投入盛有40g/L多聚甲醛溶液的小瓶中4℃固定24～48h，瓶身贴上胶纸标记，石蜡包埋存放，使用时做5μm厚连续切片。免疫组化步骤按ZYMED公司SP法操作，以PBS代替一抗做阴性对照，胞质出现棕黄色颗粒状沉积为VIP阳性表达。另以Trizol常规提取RNA，用DU-70紫外分光光度计测量RNA质量和浓度，A260/280比值为1.8～2.0。以10g/L甲醛变性凝胶电泳三条带显示清晰来证实RNA完整。逆转录获得cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增VIP的目的基因。依照美国生物信息中心（NCBI）提供的基因库（GenBank）中查找雏鸡VIP的序列（序列号：NM205366）设计PCR扩增引物，使用Primer5软件设计。VIP引物：sense primer 5’-tagaaatgcaaggcatgctg-3’,anti-sense 5’-tttcgaaagcggctgtagtt -3’，片段长177bp；β-actin引物：sense primer 5’－ catctcttgctcgaagtcca－3’， anti-sense 5’－atcatgtttgagaccttcaaca－3’，片段长310bp。反应条件为：逆转录，42℃温育60min，94℃变性5min。PCR反应条件为：94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，最后先于72℃ 10min，再于4℃保存。反应产物5μL加2.5μL载样缓冲液，在2×TBE电泳缓冲液中以15g/L琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后摄像，用Eagle Eye Ⅱ图像处理系统进行分析，VIP mRNA的相对含量用VIP与β-actin光密度的比值表示。
统计学处理：结果均以 表示，数据采用SPSS11.5软件进行分析，对照组和实验组比较采用单因素方差分析，不同浓度实验组间采用SNK-q检验，P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1眼球后壁组织VIP的表达 对照组和实验组的遮盖眼及自身对照眼的眼球后壁组织均有VIP阳性表达，主要位于视网膜光感受器外节、内核层、内丛状层和脉络膜，可见胞质呈棕褐染色，在神经节细胞层和神经纤维层有较弱表达，胞质呈淡黄着色（图1）。
2.2眼球后壁组织VIP的RNA表达 雏鸡眼球后壁组织的VIP mRNA经RT-PCR后产生一条177bp的电泳条带，内对照β-actin产生一条310bp电泳条带，对照组和实验组眼球后壁组织均有VIP mRNA表达；与对照组比较，实验组VIP mRNA表达明显上调（P＜0.01）；VIP的表达在实验组组间的差别有统计学意义，并且随药物剂量增加有逐渐上调的趋势（P＜0.05）；所有组自身对照眼的VIP mRNA表达两两比较均无明显差异（P＞0.05,图2，表1）。
3讨论
VIP是由28个氨基酸残基组成的多肽，在眼内有广泛分布，结膜、小梁网、虹膜、脉络膜、巩膜、视网膜都有VIP表达，葡萄膜存在大量VIP神经纤维，即虹膜、睫状体、睫状突、视网膜及脉络膜都存在VIP神经纤维[1]。有学者认为VIP作为一种重要的近视信使可能在视网膜水平对近视眼后部巩膜主动重塑起重要的调控作用[2]。bFGF属于多功能成纤维细胞生长因子家族，作为近视信使的一种，有很多研究都表明采用结膜下或玻璃体腔注射外源性bFGF可显著抑制FDM所导致的眼轴延长[3,4]。Rohrer等[5]对bFGF高亲和力和低亲和力受体的定位发现，通过自分泌或旁分泌，几乎所用的视网膜细胞都有bFGF和其高亲和力受体表达。在突触层（内从状层和外从状层），有高、低亲和力受体的共同结合位点，信号传导需通过高、低亲和力受体及bFGF组成的三重复合体，这种共同性结合位点位于较窄的突触层面正是高亲和力受体功能维持的基础。在视网膜中VIP通过无长突细胞分泌，因此在内丛状层有丰富的VIP能无长突细胞突触分布，然而这个部位也正是高、低亲和力受体共同结合位点丰富的层面，bFGF可能通过影响生长调节通路无长突细胞的突触传递活性及效率来调控多种神经递质，也可被这些细胞所调控，这种共同的作用可能影响着眼球的生长。本研究就是以bFGF对FDM眼中VIP表达的影响作为切入点，探讨bFGF和VIP这两种近视信使可能存在相互作用。我们发现，VIP在光感受器外节有较强表达，这一表达部位与一氧化氮合酶（iNOS）在视网膜外层的表达部位相似[6]，通常表达VIP受体的细胞90％显示有神经源性iNOS的定位[7]。bFGF可诱导视网膜色素上皮细胞生成iNOS，通过对一氧化氮生成的调节，部分参与光感
图 2 眼球后壁组织VIP PCR产物15g/L琼脂糖凝胶电泳图 1：自身对照眼；2：对照组遮盖眼；3～5:实验组1,2,4ng遮盖眼
受器的信号转换[8]。根据研究结果，外源性bFGF可能诱导iNOS生成，通过一氧化氮生成影响VIP受体活性，从而调节VIP的表达，参与光感受器的信号转换，当然这种推测还有待进一步证实，但是由于光感受器外节是近视信使作用的重要部位，因此这种推测也存在部分理论基础。由于视网膜中VIP通过无长突细胞分泌，所以在无长突细胞分布的内核层和内丛状层会出现较强VIP表达，这与我们的实验结果吻合。
由于视网膜VIP的表达依赖于光条件，在FDM大白鼠中可发现，FDM 50d后，VIP细胞数大约减少30％，回到正常视觉环境，VIP免疫活性可完全恢复[9]；在亮环境喂养的鼠，VIP表达可上调，而在暗环境喂养的鼠，几乎无法检测到VIP[10]。本实验中由于未遮盖眼接受了正常光的刺激，所以VIP mRNA表达会比对照组要高。接受bFGF玻璃体腔注射的FDM眼VIP表达虽然较未遮盖眼要低，但是随着剂量的加大，VIP表达上调，这种作用存在剂量依赖性，在高剂量组可发现VIP表达与未遮盖眼相比已没有差异，bFGF可拮抗FDM对VIP免疫活性的抑制，这种现象可能的解释为大量的外源性bFGF进入玻璃体内，通过扩散作用，到达视网膜，与所有位于内丛状层的高亲和力受体结合，组成高、低亲和力及bFGF三重复合体，复合体可通过与VIP能无长突细胞突触进行信号传导，对VIP的分泌正性上调，VIP生成增加。VIP上调可能影响视网膜内层信息传递回路，通过复杂的视网膜－脉络膜－巩膜调控机制，诱导相关信使最终作用于巩膜，导致巩膜主动重塑，因此根据本实验结果，推测VIP可能与bFGF对眼球生长作用起着相拮抗的作用。VIP和bFGF作为近视信使中的两种，它们之间的关系并不能解释整个近视的复杂的调控机制，因此深入了解各种近视信使之间的相互作用，是否存在协同或抑制作用，将有助于阐明近视的发病机制，并找到其有效的手段。在今后的研究工作中，应结合分子生物学等基础医学的先进实验技术，重于探讨哺乳类和灵长类动物实验性近视发生中各种近视信使的作用，摸索部分近视治疗药物的可行性。
【】
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