TGF-β1基因转染可抑制人晶状体上皮细胞增殖
【摘要】 目的：探讨脂质体介导的TGF-β1基因(pEGFP-TGF-β1)转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)系B3(HLEC- B3)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法：将pEGFP-TGF-β1转染HLEC-B3,观察细胞形态变化;采用生长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA倍体法)。结果：pEGFP-TGF-β1成功转染后，HLEC-B3逐渐变圆、脱壁。转染后24～48h细胞的增殖受到抑制,与相应对照组比较，差异均有统计学意义(P <0.01)；凋亡细胞比例(转染24h为（21.0±1.7） %，转染48h至（43.6±1.4）%明显升高,与相应对照组[24h为（0.42±0.06）%，48h为（0.60±0.02%)]比较,差异均有统计学意义(P <0.01)；细胞出现G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例[转染24h为（72.0±1.9 ）%，转染48h为（ 74.7±2.2）%]增加和S期细胞比例[转染24h为（20.4±2.2）%，转染48h为（19.4±1.4）%]下降,与相应对照组比较，差异均有统计学意义(P <0.01)。结论：pEGFP-TGF-β1可成功转染HLEC-B3,诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。
【关键词】 晶状体上皮细胞 TGF-β1基因 转染 凋亡
Inhibitory effect of TGF-β1 gene transfection on the proliferation of human lens epithelial cell
Abstract AIM:To investigate the effects of pEGFP-TGF-β1 plasmid DNA on proliferation and survival of human lens epithelial cell. METHODS:Immortalized human lens epithelial cell line(HLEC- B3) was transfected by pEGFP-TGF-β1 genes, respectively. Cell proliferation was analyzed by cell growth curve and MTT colorimetric assay, cell apoptosis and cell cycle of HLEC-B3 were examined by flowcytometry. RESULTS:HLEC-B3 cells were transfected successfully, pEGFP-TGF-β1 suppressed the growth rate, enhanced the cell apoptosis(21.0±1.7) % after 24 hours and (43.6±1.4 )% after 48 hours transfection. The proportions of G1 phase cells were increased to (72.0±1.9)% after 24 hours and (74.7±2.2)% after 48 hours transfection, while the proportions of S phase cells were decreased to(20.5±2.2)% after 24 hours and (19.4±1.4)% after 48 hours transfection. CONCLUSION: pEGFP-TGF-β1 genes can successfully transfect HLEC-B3, inhibit proliferation and induce apoptosis of HLEC-B3.
· KEYWORDS: lens epithelial cells; TGF-β1 genes; transfection; apoptosis
0引言
转化生长因子TGF-β1可以参与并调节多种生物学反应过程,其中包括:细胞的生长与分化、细胞粘连及细胞外基质的形成、伤口的愈合、免疫调节及胚胎发育过程等。许多研究表明,高表达活性TGF-β1的转基因鼠和其体外培养鼠晶状体均出现晶状体浑浊的症状[1,2]，实验证明TGF-β1可抑制许多正常细胞和肿瘤细胞的生长,并使这些细胞停滞在细胞周期的第一个间隔区:G1期,从而阻止细胞进入S期[3]。本研究的目的是通过应用基因转染技术将外源性TGF-β1基因转染至体外培养的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC),观察TGF-β1基因在人晶状体上皮细胞的表达及其对细胞增殖、凋亡的影响,以期为临床研究白内障的发生机制和防治方法提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料 永生化细胞系:HLEC-B3(医科大学眼科提供),HG-DMEM培养液购自美国Highclone公司,胎牛血清购自杭州四季青生物公司, pSNAV-TGF-β1质粒购于北京本元正阳基因技术有限公司，pEGFP-C2质粒中国医科大学微生物教研室提供，Lipofectamine2000购于Invitrogen公司,碘化丙啶（PI）购于Sigma公司，Triton-X-100购于BDH公司，CO2细胞培养孵箱(Heraeus)，超净工作台(Nuair)，低温高速离心机(Heraeus)，倒置显微镜( Olympus)。
1.2方法 复苏时将冻存细胞系HLEC -B3从液氮罐中取出,快速放入37℃温水中溶解,溶化后以1 200/min离心约3～5min,离心半径为15cm。弃培养液后，放入含150mL/L胎牛血清，100mg/Ｌ青霉素及125mg/Ｌ链霉素的HG-DMEM培养基中,置于50mL/L CO2、37℃的细胞培养箱内培养。EcoR 和Sal 双酶切pSNAV-TGF-β1,回收插入片断（1.8kb），EcoR 和Sal 双酶切pEGFP-C2,回收线性载体(4.7kb)，连接上述二种回收的DNA，转化,筛选克隆，构建后的质粒命名为pEGFP- TGF-β1。基因转染前1d将细胞接种至6孔板,细胞密度为1×108个/Ｌ,在50mL/L CO2、37℃饱和湿度下培养24h，90%细胞达到融合;转染前使用PBS缓冲液冲洗细胞1次,更换不含抗生素的培养液。用无血清的HG-DMEM 250μL稀释pEGFP- TGF-β1 4μg，温和摇均。使用前轻轻混均Lipofectamine2000，然后将Lipofectamine2000 10μL加入无血清的HG-DMEM 250μL，混匀并于室温温育 5min。混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine2000，混匀，室温下放置20min。将质粒/ Lipofectamine2000复合物加入到6孔板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养，6h后更换含150mL/L胎牛血清的HG-DMEM培养基。将转染细胞,每日在倒置显微镜下观察并记录细胞的形态变化。接种HLEC- B3至6孔板,每孔5×103个细胞,培养过夜。实验组将pEGFP-TGF-β1转染细胞,对照组以150mL/L胎牛血清HG-DMEM代替。转染后24，48， 72，96h,分别消化收集细胞,细胞数量。每个时间点上设3个样本。
1.2.1 HLEC- B3增殖的变化 采用MTT比色法。接种HLEC- B3至96孔板,每孔103个细胞、培养液100μL（不含抗生素）培养过夜。实验组为转染细胞（每孔加入质粒0.2μg, Lipofectamine2000 0.5μL）,对照组以150mL/L胎牛血清HG-DMEM代替,每孔50μL。转染后24，48，72，96h,加入5g/L MTT溶液,每孔20μL，37℃，4h。弃上清,每孔加入二甲基亚砜150μL,微量振荡器振荡10min,用酶标仪检测其在492nm处的吸光度(A 值)。每个时间点设6个样本。1.2.2细胞周期和凋亡的测定 实验组将pEGFP-TGF-β1转染HLEC-B3,对照组以等量含150mL/L胎牛血清HG-DMEM代替,24，48，72，96h后收集细胞,将细胞消化离心收集,经700mL/L冰乙醇固定,4℃保存过夜。使用前用pH值为7.4的PBS缓冲液冲洗3次,离心弃上清，加入10g/L RNA酶溶液1mL, 10g/L Triton-X-100溶液0.1mL, 37℃,温育10min，将细胞数调整至1×109个/Ｌ,取1mL细胞悬液;离心弃上清,加入PI溶液1mL，混匀后4℃避光染色20min。使用流式细胞仪检测。
统计学处理：使用SPSS10. 0软件分析系统，两组间结果比较采用Student t 检验。
2结果
2.1 HLEC- B3的生长 转染pEGFP-TGF-β1后，24h细胞由贴壁生长的梭形、星形、多角形逐渐变圆、贴壁不牢、皱缩; 48～72h时细胞脱落;72～96h时细胞绝大部分漂浮于培养液中(图1)。实验组pEGFP-TGF-β1转染24h后,活细胞数量开始减少,96h时活细胞数量降至0.39×104个,为对照组(9.25×104个)的4.2%,两者比较差异有统计学意义 (t =71.58,P <0 01，图2)。实验组pEGFP-TGF-β1转染24h时,细胞增殖程度明显减弱,48，72，96h时增殖程度进一步减弱(表1)。不同观察时间实验组与对照组比较,差异均有统计学意义(t =6.46,29.50,83.78,71.80;P <0.01)。
图 1 HLEC形态 A：正常对照组细胞呈梭形、星形、多角形×10；B：转染pEGFP-TGF-β1后，24h细胞由贴壁生长逐渐变圆、贴壁不牢、皱缩×10；C：48h时细胞脱落×20；D：96h时细胞绝大部分漂浮于培养液中×20；E： pEGFP-TGF-β1转染后24h，细胞荧光表达，证明转染成功 荧光显微镜×40
图2 pEGFP-TGF-β1转染后HLEC-B3的生长
2.2 HLEC-B3凋亡细胞周期的变化 流式细胞仪检测实验组pEGFP-TGF-β1转染24h,凋亡细胞比例达（21.0±1.7 ）%,与对照组（0.42±0.06）%比较，差异有统计学意义(t = -29.01,P <0. 01，表2)。转染后48h,凋亡细胞比例升高至（43.6±1.4）%,与对照组（0.60±0.02）%比较（t = -76.02,P <0. 01），差异有统计学意义，转染后96h细胞大部分死亡。实验组pEGFP-TGF-β1转染24h后出现了细胞G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例增加和S期细胞比例减少(表2)。转染24h实验组G1期和S期细胞比例与对照组比较,差异均有统计学意义(t =-13.318, 11.084, P <0 .01，表2)。
3讨论
转化生长因子TGF-β共分3个亚型TGF-β1, β2和β3，它们对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、血管的生成、细胞凋亡及机体免疫系统均起着重要的调节作用。转化生长因子的生物学作用主要通过TGF-β的胞内信号通路起作用，目前人们已经发现的TGF-β信号通路主要有3条：(1) 经典通路TGF-β-TβR-Smads; (２)TGF-β-TβR -TAB1 TAK1 通路;(３)TGF-β-TβR- p21ras- MEK-ERK通路。现已证明转化生长因子TGF-β可以经通路1和2对细胞产生生长抑制作用。而对于通路3，由于不同的细胞有不同的转录因子，从而出现完全不同的生物学效应，表现为细胞特异性[4-9]。例如对上皮来源的细胞表现为明确的生长抑制作用，而对某些间充质来源的细胞却表现为生长促进晶状体细胞凋亡是除先天性白内障外各型白内障发生的共同分子机制，实验表明,TGF-β1在各型白内障，特别是前、后囊下白内障中明显升高，并可影响晶状体上皮细胞的形态,使晶状体上皮细胞变长、聚集,逐渐形成多层,光镜下可见细胞间有许多交锁突起,电镜下发现细胞内细胞器减少,RNA聚集,核染色质边缘化,细胞质凝集,二级溶酶体明显增多,这些现象的出现标志着细胞凋亡[10]。我们将外源性TGF-β1基因转染永生化HLEC,观察细胞在增殖、凋亡及细胞周期等方面的变化。结果发现pEGFP-TGF-β1可以成功转染HLEC-B3,转染效率即达21%。细胞生长曲线和MTT比色法均发现pEGFP-TGF- β1转染后的HLEC-B3增殖活动明显受到抑制，生长速度明显减慢,部分细胞死亡;流式细胞仪检查结果显示,呈现类似细胞凋亡的波峰,凋亡率升高，且Ｇ1期明显提前，最终抑制细胞生长周期G1/S期过渡实现的。细胞周期调控,尤其G1期调控是细胞整合内在和外在各种信号、刺激最为精细复杂的时相,不仅是细胞增殖调控最关键的时期,而且与细胞的凋亡密切相关。本研究证明TGF-β1作用与细胞周期关系密切，它通过诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡，导致白内障的发生。但其对人晶状体细胞周期影响的具体分子机制, 及可能的应用前景，尚有待于进一步研究。
【】
1 Lovicu FJ, Schulz MW, Hales AM, VincentLN, Overbeek PA, Chamberlain CG, McAvoy JW.TGF inducesmorphologicaland molecular changes typical of anteriorsubcapsular cataract. Br J Ophthalmol , 2002;86:220-226
2 Srinivasan Y, Lovicu FJ, Overbeek PA. Lensspecific expression of transforming growth factor 1 in transgenic mice causes anteriorsubcapsular cataracts. J Clin Invest ,1998;101:625-634
3 Pak JH , Kim TI, Kim MJ, Kim JY. Reduced expression of 1-cys peroxiredoxin in oxidative stress-induced cataracts. Exp Eye Res ,2006; 82:899-906
4 Piek E, Heldin CH, Dijke PT. Specificity divercity and regulation in TGF-β super family signaling. FASEB 1999;13:2105-2124
5 Hanafusa H, Ninomiyn Touji J, Gay CG. Involvement of the p38mitogen-ativated protein kinase pathway in TGF-β induced gene expression. Biol Chem ,1999;274:27161-27167
６ Sano Y, Harada J, Tashiro S, Denk PO. ATF-2 is a common nuclear target of Smad and TAKI pathways in transforming growth factor-βsignaling. Biol Chem ,1999;274:8949-8957
７Hartsough MT, Mulder KM. Transforming growth factor-β activation of P44 mapkin proliferating cultures of epithelial cells. Biol Chem ,1995;270:7117-7124
８Yamamoto H, Atsuchi N, Tanak H. Separate roles for H-Ras and Racin signaling by transforming growth factor(TGF)- Β H-ras is essential for actvation of MAP kinase patially required for transcriptional activativon by TGF-β. Eur J Biochem ,1999;264:110-119
9 Yang Y, Zhou SB. Immunosuppressive action of transforming growth factor betel after corneal transplantation. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2006;6(4):851-853
10 Maruno KA, Lovicu FJ. Apoptosis is a feature of TGFbeta-induced cataract . Clin Exp Optom ,2002;85:76-82
