原花青素抗氧化活性的相关研究
【摘要】 原花青素(Procyanidins，PC)是从多种植物中提取的一类物质。具有多种生物活性，是一种很强的抗氧化剂，能清除自由基抑制脂质过氧化发生，PC的低聚体发挥了重要作用。本文主要从与PC抗氧化活性有关的研究加以综述。
【关键词】 原花青素 低聚体 抗氧化 保护
Antioxidant activity of procyanidins and its related study
· KEYWORDS: procyanidins; oligomeric; antioxidation; protection
0引言
原花青素(Procyanidins,PC)是植物王国中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究与深刻认识，现已成为独树一帜的一大类物质并称之为原花青素。原花青素主要分布在葡萄、银杏、大黄、山楂、小连翘、花旗松、日本罗汉柏、白桦树、野草莓、海岸松、甘薯等植物中，但研究发现葡萄籽提取物中原花青素的含量最高。20世纪80年代以来，人们对数十种植物的原花青素低聚体和高聚体进行了生物、药理活性的研究，发现原花青素是一种很强的抗氧化剂，具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等多种生物学活性。
1原花青素抗氧化性与结构的关系
原花青素呈粉末状，易溶于水、乙酸、乙醇、丙酮等溶剂。原花青素由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二～四聚体称为低聚体，将五聚体以上的称为高聚体。在各类原花青素中，二聚体分布最广，研究最多，是最重要的一类原花青素。
原花青素之所以表现很强的抗氧化作用，由于B环上具有相邻二酚羟基广泛的非定域化，使得相应的氧化形式另外获得稳定状态。另外，在其高分子结构中，几个与O原子邻位的二羟酚基使得原花青素充分与金属离子(Fe(III)， Cu(II)，Al(III)及蛋白结合，络合作用的贡献在于阻止了催化自由基反应的金属离子的活性，这是原花青素具有营养和生物学价值的主要特征[1]。
黄烷间的连接类型(C4与C6结合，C4与C8结合)对原花青素捕获自由基抗氧化有很大影响，提示原花青素在水溶液中所采取的构象不同影响了它们的亲水特性，因而影响了它们与水相和脂质相中过氧化氢的相互作用[2]。二聚体中，因两个单体的构象或键结合位置的不同，可有多种异构体，已分离鉴定的8种结构形式分别命名为B1～B8，其中，B1～B4是由C4→C8键合，B5～B8由C4→C6键合。Faria等[3]通过监测耗氧量和测量共轭双烯的形成评价原花青素5种不同结构成分(单体，直到五聚体)的抗氧化能力，被实验的成分都能通过增加氧化作用的诱导时间来保护细胞膜对抗过氧化氢自由基的损害。这种作用效果呈增加趋势，直到二聚体作用最强，之后可能由于空间位阻现象的存在，随着结构复杂性的增加抗氧化作用降低。而Silva等[2]通过研究低聚原花青素抗氧化性能与结构的关系显示，随着由单体构成的二聚体、三聚体等聚合度的增加，抗氧化活性也随之增加。可能是自由羟基和氢原子数量的增加，提高了水相中抗氧化剂的功效；随着聚合度的增加，这些化合物对脂质相的分配系数也增加。
2原花青素在体内的吸收代谢
原花青素在营养学中备受关注，尤其在西方饮食中，因为它占人们摄入酮类中的一大部分，对人体健康很有帮助。然而人们仍不是很清楚在体内发挥有益作用的究竟是原花青素的单体、低聚体，还是肠道微生物的芳香族酸的衍生物。围绕这个争论，Garcia等[4]用一种合成的低聚原花青素(包含由乙基桥联的表儿茶素单位)喂养雄性Wistar大鼠(200 mg/kg体重)，这种合成的原花青素(synthetic PC ，SPC)还包括二聚体、三聚体、四聚体。食入1h后，在血浆中检测出四甲基化二聚体原花青素(TDPC)，食用2h后，血浆中达最高浓度(14 mg/L)，同时肝脏中每克组织中也含有15 mug的TDPC。研究表明，口服二聚体原花青素能很快吸收，并在体内甲基化。该实验是首次在血浆和肝脏中检测出甲基化的二聚体原花青素。Garcia等认为，血浆和肝脏中的TDPC发挥了激素样效应，且在原花青素和富含原花青素的食物中，原花青素二聚体是最佳的生物活性物质。在Shoji等[5]分析苹果原花青素的吸收情况时也证实了原花青素低聚体能很快被大鼠吸收，直接参与体内的生理功能，且多聚体原花青素影响低聚体的吸收。
Tsang等[6]将葡萄籽提取物包括儿茶素、表儿茶素，原花青素的二聚体、三聚体、四聚体和多聚体喂养大鼠，24h后检测肝、肾、脑和胃肠道以及收集血浆、尿和排泄物，高效液相色谱法分析它们的黄烷-3-醇含量。食入1h后，少量的黄烷-3-醇从胃排空到十二指肠，很大程度地到达回肠，2h后进入盲肠，3h后有相对较少量的被检测到进入结肠。胃肠道，以及胃肠外的葡萄籽提取物黄烷-3-醇和仅能示踪的原花青素，还不能证明原花青素是在胃肠道解聚释放出黄烷-3-醇。特别是在血浆中含有较多的儿茶素葡糖苷酸和甲基化葡糖苷酸代谢产物，在肝、肾中也检测到这些物资，尿液中也表现有这些物资以及硫酸盐代谢物，和少量原花青素二聚体B1， B2， B3 和B4，以及三聚体C2和未知的原花青素三聚体。24h后在尿液中检测出的儿茶素和表儿茶素代谢物的量分别是摄入单体量的27% 和36 %，此水平与其他研究者报告的结果也相一致，该结果显示，葡萄籽提取物中的原花青素低聚物食入后在任何程度上没有解聚成单体形式。还没有充分的分析数据能证明在脑中有黄烷-3-醇代谢物存在。
3原花青素抗氧化性的药理作用
原花青素可提供猝灭多种活性氧自由基所需要的氢(H)，对能引起生物组织膜因发生过氧化作用而导致结构和功能损伤的羟(OH)自由基等有明显的清除作用，从而起到对生物器官的保护作用。
3.1抗脂质过氧化和清除自由基作用 许多研究证明，原花青素具有很强的抗氧化活性，是一种很好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂。Bagchi等[7]用小鼠进行体内实验，用葡萄籽提取物原花青素、VC、VE琥珀酸盐(VES),β-胡萝卜素对TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate ，12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸盐)诱导的肝、脑组织中脂质过氧化的保护作用进行了比较，发现在100 mg/kg BW剂量下原花青素、VC、VES、β-胡萝卜素均可降低TPA诱导产生的活性氧簇，使用腹腔巨噬细胞发光法降低率分别为70％ 、18％ 、47％和16％ ，使用细胞色素还原法降低率分别为65％ 、15％ 、37％ 和19％ ，同时还发现原花青素对于抑制TPA诱导的脂质过氧化反应以及腹腔巨噬细胞活性氧的产生，具有剂量反应关系。结果表明，葡萄籽提取物原花青素可对氧化损伤起到保护作用，且保护作用优于其它抗氧化剂。此外，Bagchi等[8]的体外试验也获得了相似的结果。我们分别使用化学发光法和细胞色素C还原法测定了葡萄籽提取物原花青素、VC、VE清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力。结果表明，原花青素对自由基的抑制具有浓度反应关系，在100mg/L的浓度时，原花青素对超氧化阴离子和羟基自由基的抑制能力分别为78％和81％ ；同等条件下，VC抑制上述两种自由基的能力分别为12％和19％ ，VE为50％ 和75％ ，说明原花青素是一种比VC、VE更强的自由基清除剂。
Simonetti等[9]评价体外补充葡萄籽提取物原花青素对有氧化应激者的影响，10名健康自愿者每日口服110mg原花青素30d，服用前后抽取静脉血，比较发现，总抗氧化能力以及血浆中α-生育酚浓度没有改变，而红细胞膜中α-生育酚浓度从1.8±0.1 增加到2.8±0.2 mg/g，DNA被氧化的淋巴细胞从7.23±2.47 减少到2.34±0.51，并且红细胞膜中脂肪酸的构成变为高水平的不饱和脂肪酸。结果表明，服用原花青素可发挥在体内的抗氧化保护作用，可节约体内脂溶性维生素E，减少淋巴细胞DNA的氧化损伤。Nuttall等[10]通过临床研究葡萄籽提取物原花青素对血浆总抗氧化能力(TAC)、VC、VE水平的影响，对20位自愿者采取随机单盲、安慰剂对照研究，让受试者服用含300mg原花青素的胶囊2颗或安慰剂连续5d，5d后采集血样，间隔至少2wk后重复研究。结果显示，血浆中VC、VE的含量没有变化，而TAC水平提高，第5d时，TAC从408.1±22.9 提高到453.3±453.3。研究表明，葡萄籽提取物原花青素能提高血浆TAC，但其临床应用还需进一步随机实验研究。
3.2保护细胞作用 许多原发性、进展性退行性疾病被认为与过度的过氧化反应有关，Zhu等[11]研究了从可可提取物儿茶素、表儿茶素、原花青素低聚物对自由基引起的小鼠红细胞溶血的影响，体外研究发现，儿茶素、表儿茶素、原花青素低聚物在2.5~40μmol/L时存在剂量依赖性保护作用，其中二聚体、三聚体、四聚体表现出最强的抑制作用：10μmol/L时，对溶血抑制率分别是59.4%， 66.2%， 70.9%；20 μmol/L时，84.1%， 87.6%， 81.0%； 40μmol/L时，90.2%， 88.9%， 78.6%。之后进一步研究，A组：用100mg原花青素给小鼠灌胃；B组：对照组，灌生理盐水。测血浆总抗氧化能力，发现A组灌胃后30~240min时血浆抗氧化能力明显提高 (P < 0.05)，红细胞抗溶血能力增强(P < 0.05)。同时将A组小鼠的红细胞与B组小鼠的血浆混和，发现A组小鼠红细胞的抗溶血能力增强；将A组小鼠的血浆与B组小鼠的红细胞混合，发现B组小鼠的红细胞抗溶血能力也增强。结果表明，可提取物儿茶素、表儿茶素、原花青素低聚物具有很强的细胞膜保护作用。
Roychowdhury等[12]通过体外细胞培养研究葡萄籽提取物原花青素对神经小胶质细胞氧化应激的保护作用，结果显示，用50mg/L的原花青素处理过的神经小胶质细胞对H2O2的耐受性提高，分析表明，原花青素减低了神经小胶质细胞内NO的产生，同时，在NO产生时，葡萄籽提取物原花青素可提供对细胞内GSH(还原型谷光苷肽)的保护作用，因而提高了H2O2损伤后细胞的活性。Lu等[13]通过致癌物质PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate，12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐)损伤模型研究葡萄籽提取物原花青素对肝细胞的保护作用，单细胞凝胶电泳显示，原花青素能有效保护PMA引起的DNA损伤，抑制PMA介导的H2O2产生，另外还可抑制肝线粒体脂质过氧化反应，保护肝线粒体SOD(超氧化物歧化酶)活性及降低MDA(丙二醛)的含量。Li等[14]还将葡萄籽提取物原花青素对氧化损伤后的细胞的程序性死亡及线粒体跨膜电位的影响进行研究，将离体大鼠胸腺细胞H2O2损伤后，流式细胞计量法检测，细胞程序性死亡及线粒体跨膜电位分别是(29.53±3.8) %和(27.24±2.2) %，用浓度为50mg/L的原花青素处理后，检测值分别是(8.61±1.2)%和(87.55±4.7) %，两实验组差别有显著性,表明葡萄籽提取物原花青素能抑制氧自由基损伤后的细胞程序性死亡及降低线粒体跨膜电位。
3.3抗肿瘤作用 原花青素能与蛋白结合并改变其结构，因而能调节代谢途径中关键酶和蛋白活性。另外原花青素影响氧化还原反应敏感的信号传导途径，改变其基因表达[9]。Puiggros等[15] 评价了葡萄籽提取物原花青素对肝癌细胞株HepG2的作用效果，RT-PCR和分光光度法测试mRNA和酶活性水平。在氧化状态下(1mmH2O2，1h)，癌细胞的GSH(还原型谷光苷肽)含量下降，MDA含量升高，由于GPx/GR(谷光苷肽过氧化物酶/谷光苷肽还原酶)mRNAs的后调控调节及GSTmRNA的调节增强所致。用葡萄籽提取物原花青素处理(15mg/L，24h)后的实验组与氧化组相比，GPx/GR表达增加，GSH含量与氧化组无显著差异，且GPx/GR酶的活性没有明显增加。研究者分析，在浓度为15mg/L时原花青素主要通过增强mRNA和酶活性的表达来调节与谷光苷肽相关的酶，而不单是通过调节GPx/GR酶的活性来预防氧化损伤。Faria等[16]通过原花青素5种不同结构成分(单体，直到五聚体)分别作用于人乳腺癌细胞株MCF-7来评价这些化合物对细胞成活力和增殖的影响，结果显示，在30mol/L时，二聚体和三聚体能降低细胞的成活力和增殖，而在60mol/L时没有这种作用。儿茶素在30和60mol/L时都能减少细胞的成活力和增殖。实验还发现，原花青素的这些成分所表现的较高的抗氧化活性对细胞成活力、增殖效果都是一样的，其作用机制还需进一步研究。
3.4预防白内障作用 氧化损伤是白内障发生中最具有意义的环节，许多实验都证明晶状体的氧化损伤发生在晶状体混浊之前。抗氧化剂如维生素C、维生素E和胡萝卜素能阻止实验诱导的白内障的发生已有诸多报道，然而，原花青素对白内障的形成的影响还很少有研究。Yamakoshi等[17]用葡萄籽提取物(含原花青素38.5%)喂养遗传白内障小鼠(ICR/f 鼠)，采取标准饮食，食物中原花青素的含量是0或0.082%。27d后裂隙灯下观察，葡萄籽提取物能明显阻止或推迟白内障的形成，与对照组相比，晶状体的重量和MDA含量及血浆胆固醇酯过氧化氢(ChE-OOH)水平明显降低。结果表明，原花青素和其抗氧化代谢产物由于它们的抗氧化活性能预防白内障的形成。
3.5对其它药物的协同作用 某种药物和营养物质的吸收与作用效果受一同食入的其它物质的影响很大。Faria等[18]研究食入原花青素对人肠吸收有机阳离子的调节作用，从葡萄籽提取5种不同结构的原花青素，评价对Caco-2细胞吸收MPP+（1-甲基-4-苯基吡啶）的影响。暴露于600μg的原花青素60min后，Caco-2细胞对3H-MPP+的吸收增加，并且增加程度与原花青素的结构复杂性相关。已证实，随着前保温时间的增加，对3H-MPP+的吸收也增加，推测这与在前保温时原花青素被氧化有关，运载体的运载活性能干涉这种变化，已被证实的抗氧化剂表明，运载体的氧化还原状态可影响它的活性。另外，反刺激实验表明，儿茶素、二聚体能用作MPP+的运载体，此结果与原花青素作为MPP+运载体的竞争抑制剂的假设相一致。总之，原花青素能调节MPP+在Caco-2细胞内的吸收，这种调节最可能是通过氧化—还原反应现象实现。饮食中这些化合物和药物之间的相互作用能影响它们的吸收和利用度，在实际应用中要考虑到原花青素的浓度和其结构的复杂性。
4展望
原花青素抗氧化的生物学作用，与人类的生活和健康密切相关，在营养、医药、保健等领域具有重要的应用价值。因此，我们应充分利用我国的植物资源，如葡萄、甘薯、山楂、银杏、大黄、莲房等，结合我国传统中医药技术，开发出适宜又有功效的原花青素产品，为临床氧化损伤性疾病提供新的思路。
【】
1 Rice-Evans CA, Miller NJ, Paganga G. Structure–antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med ,1996;20(7):933-956
2 da Silva Porto PA, Laranjinha JA, de Freitas VA. Antioxidant protection of low procyanidinsdensity lipoprotein by procyanidins: structure/activity relationships. Biochem Pharmacol ,2003;66(6):947-954
3 Faria A, Calhau C, de Freitas V, Mateus N. Procyanidins as antioxidants and tumor cell growth modulators. J Agric Food Chem ,2006;54(6):2392-2397
4 Garcia-Ramirez B, Fernandez-Larrea J, Salvado MJ, Ardevol A, Arola L, Blade C. Tetramethylated dimeric procyanidins are detected in rat plasma and liver early after oral administration of synthetic oligomeric procyanidins. J Agric Food Chem ,2006;54(7):2543-2551
5 Shoji T, Masumoto S, Moriichi N, Akiyama H, Kanda T, Ohtake Y, Goda Y. Apple procyanidin oligomers absorption in rats after oral administration: analysis of procyanidins in plasma using the porter method and high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J Agric Food Chem ,2006;54(3):884-892
6 Tsang C, Auger C, Mullen W, Bornet A, Rouanet JM, Crozier A, Teissedre PL. The absorption, metabolism and excretion of flavan-3-ols and procyanidins following the ingestion of a grape seed extract by rats. Br J Nutr ,2005;94(2):170-181
7 Bagchi D, Garg A, Krohn RL, Bagchi M, Bagchi DJ, Balmoori J, Stohs SJ. Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation, and peritoneal macrophage activation in mice. Gen Pharmacol ,1998;30(5):771-776
8 Bagchi D, Garg A, Krohn RL, Bagchi M, Bagchi DJ, Balmoori J, Stohs SJ. Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E, and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro.Res Commun Mol Pathol Pharmacol ,1997;95(2):179-189
9 Simonetti P, Ciappellano S, Gardana C, Bramati L, Pietta P. Procyanidins from Vitis vinifera seeds: in vivo effects on oxidative stress. J Agric Food Chem ,2002;50(21):6217-6221
10 Nuttall SL, Kendall MJ, Bombardelli E, Morazzoni P. An evaluation of the antioxidant activity of a standardized grape seed extract, Leucoselect. J Clin Pharm Ther ,1998;23(5):385-389
11 Zhu QY, Holt RR, Lazarus SA, Orozco TJ, Keen CL. Inhibitory effects of cocoa flavanols and procyanidin oligomers on free radical-induced erythrocyte hemolysis. Exp Biol Med (Maywood) , 2002;227(5):321-329
12 Roychowdhury S, Wolf G, Keilhoff G, Bagchi D, Horn T. Protection of primary glial cells by grape seed proanthocyanidin extract against nitrosative/oxidative stress. Nitric Oxide ,2001;5(2):137-149
13 Lu Y, Zhao WZ, Chang Z, Chen WX, Li L. Procyanidins from grape seeds protect against phorbol ester-induced oxidative cellular and genotoxic damage. Acta Pharmacol Sin ,2004; 25(8):1083-1089
14 Li L, Zhong J. Effect of grape procyanidins on the apoptosis and mitochondrial transmembrane potential of thymus cells. weisheng YanJiu,2004;33(2):191-194
15 Packer L, Rimbach G, Virgili F. Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, pycnogenol. Free Radic Biol Med , 1999;27(5-6):704-724
16 Puiggros F, Llopiz N, Ardevol A, Blade C, Arola L, Salvado MJ. Grape seed procyanidins prevent oxidative injury by modulating the expression of antioxidant enzyme systems. J Agric Food Chem ,2005;53(15):6080-6086
17 Yamakoshi J, Saito M, Kataoka S, Tokutake S. Procyanidin-rich extract from grape seeds prevents cataract formation in hereditary cataractous (ICR/f) rats. J Agric Food Chem ,2002;50(17):4983-4988
18 Faria A, Mateus N, de Freitas V, Calhau C. Modulation of MPP+ uptake by procyanidins in Caco-2 cells: involvement of oxidation/reduction reactions. FEBS Lett ,2006;580(1):155-160
