VIPmRNA在鸡形觉剥夺性近视眼球后壁组织中的表达
作者：王平宝，刘双珍，王华，蒋晶晶，吴小影，谭星平，夏朝华
【摘要】 目的：探讨雏鸡高度近视眼眼球后壁组织血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide ,VIP）mRNA的动态表达及意义。 方法：选择出生1d来亨雏鸡共30只，15只右眼遮盖作为实验组，分别持续遮盖1，2和4wk;另15只双眼均未遮盖作为正常对照组。两组均采用检影验光检测屈光度;眼科A超测定活体眼轴长度；对两组3个时间段眼球后壁行RT-PCR检测VIPmRNA的动态表达。结果：实验组由实验前远视眼快速演变为高度近视眼，并随遮盖时间延长，近视度数加深，眼轴延长；两组眼球后壁均有VIPmRNA阳性表达；随出生时间延长两组VIPmRNA表达均逐渐增强。与对照组相比，实验组VIPmRNA表达明显上调（P<0.01）。结论：形觉剥夺可导致高度近视眼；高度近视眼较正常眼VIPmRNA表达明显上调。VIP可能参与了近视眼形成与的调控。
【关键词】 形觉剥夺性近视眼
0引言
近视眼在普通人群中的患病率很高，全世界平均患病率为10%～40%；我国有3亿以上的近视眼，恶性近视眼约2 000万[1]。恶性近视眼是青壮年主要的致盲性眼病之一。由于对近视眼的发病机制不明，因此阐明近视眼的发病机制，从病因上近视眼是眼科工作者亟待解决的关键问题。血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）是一种特殊的神经肽递质，具有神经递质、神经调质和神经自分泌等多种功能。作为视觉信息分子，VIP在视觉诱导近视眼形成的过程中可能起到视觉信息传递和调控的作用。目前关于VIPmRNA在形觉剥夺性近视眼（form deprivation myopia, FDM）中表达及作用如何，尚未见报道。为探讨VIPmRNA在FDM眼球后壁中的表达是否有改变，我们采用RT-PCR方法从核酸信息转录水平检测VIPmRNA在小鸡FDM动物模型中随形觉剥夺时间延长的动态表达。
1材料和方法
1.1材料 随机选择出生1d的健康黄色来亨雏鸡30只，雌雄不拘，眼部无充血及分泌物，裂隙灯及直接眼底镜检查屈光间质清晰。其中15只当日用半透明塑料眼罩（10mL塑料试管底部制作）单眼（右眼）遮盖作为实验组，遮盖时间为1，2，4wk，每周各5只雏鸡，建立不同时间段FDM动物模型；另15只雏鸡双眼均未遮盖作为正常对照组。饲养温度维持在20～25℃ ，光照与黑暗周期比为12h∶12h，专用雏鸡饲料、专人饲养。实验过程中眼罩脱落或遮盖欠佳的雏鸡被淘汰。分别于实验前、实验1，2，4wk，行双眼瞳孔下暗室视网膜检影验光，测量双眼屈光度数，由有经验的验光师专人检影；采用眼科A超测量4个时间段活体双眼眼轴长度，测量前，眼局部滴10g/L地卡因1次，每眼测量3次，取平均值，由专人测量。 分别于实验1，2，4wk，将不同时间段实验组和对照组各5只雏鸡断颈, 无菌快速摘除眼球，沿眼球赤道部切开，去除玻璃体，取其眼球后壁组织，快速标记并放入液氮中冷冻保存，后移入-70℃深低温冰箱中保存，RT-PCR备用。
1.2方法
1.2.1眼球后壁组织VIPmRNA的RT-PCR半定量检测 全部标本常规行眼球后壁组织总RNA的提取与逆转录合成cDNA；雏鸡VIP mRNA序列由美国生物信息中心（NCBI）提供的基因库（Genbank）中查找获得（基因序列号：VIP为NM205366），利用Primer5引物设计软件，根据mRNA序列设计高分值VIP引物序列（上海华大基因有限公司合成）；β-actin引物直接由北京鼎国生物公司提供。引物序列为:VIP引物:Forward Primer 5’tagaaatgcaaggcatgctg 3’, Reverse Primer 5’tttcgaaagcggctgtagtt3’,片段长度177 bp ; 内参照β-actin 引物: Forward Primer 5’ catctcttgctcgaagtcca 3’, Reverse Primer5’ atcatgtttgagaccttcaaca 3’, 片段长度310bp。反应条件：94℃5min→[94℃1min→55℃45s→72℃45s]×30cycles→72℃10min；反应体系相应试剂加入完全后，短暂离心，以25μL石蜡油覆盖；去离子亚沸水替代cDNA模板作为PCR扩增反应的空白阴性对照；取雏鸡小肠组织cDNA为模板作为阳性对照；以上均放入PCR热循环仪中进行扩增。
1.2.2 RT-PCR扩增产物半定量 15g/L琼脂糖+ 0.5×TBE溶液配胶，0.5mg/L溴乙锭显色，6μL扩增产物+1μL6×溴酚兰buffer混匀点样，电压为100V，通电时间为20～30min，紫外线下观察PCR电泳结果。将凝胶放入Eagle Eye Ⅱ图像处理系统摄像并测量产物吸光度值（A值），并每个样本在同一个反应体系中与β-actin A值的相对比值，以便作统计分析。
统计学处理：采用Statistica统计软件行方差齐性分析，在此基础上,两组之间比较用t检验，多组之间两两比较用q检验,直线相关分析，以P < 0.05为差异具有显著性，有统计学意义。
2结果
2.1眼屈光度数、眼轴长度与形觉剥夺时间相关分析 刚出生雏鸡均呈远视状态，眼轴短；随时间延长，对照组远视度数减低，眼轴延长，周龄与远视屈光度数呈负相关（r＝-0.88，P <0.01）；实验组眼屈光度由实验前远视快速演变为高度近视，眼轴明显增长，两者呈负相关（r＝-0.94, P <0.01）；两组之间实验前眼屈光度数、眼轴长度无明显差异（P > 0.05）；但实验组形觉剥夺后，两组之间眼屈光度数、眼轴长度进行比较，有统计学差异（P <0.01，表1）。
2.2逆转录聚合酶链反应结果 全部实验组和对照组雏鸡的眼球后壁组织提取的总RNA经15g/L琼脂糖电泳后，证实有28S，18S，5S三个清晰的电泳条带；紫外线分光光度计测定所有RNA的A260/280比值均在1.8～2.0之间；表明RNA既无降解，也无明显污染。雏鸡眼球后壁组织的VIPcDNA经RT-PCR后，产生一条分子质量为177bp电泳条带，而内对照β-actin产生一条分子质量为310bp电泳条带，经Eagle Eye Ⅱ图像处理系统摄像并测定VIP与β-actin光密度值（A）比较显示：对照组与实验组眼球后壁组织均有VIPmRNA表达；随出生时间延长，VIPmRNA表达逐渐增强。与正常对照组比较，实验组 VIPmRNA (P <0.01)表达明显上调（t =15.892，16.278，21.480，P < 0.01，表2, 图1)。
N:阴性对照; P:阳性对照; M:DNA分子质量Marker(100~ 1 000bp)；A1,A2,A3为实验组实验1,2,4wk; B1,B2,B3为对照组实验1,2,4wk
图1 眼球后壁组织VIPmRNA表达电泳结果
3 讨论
近视眼发病机制不明,目前尚无有效的病因学治疗。我们通过建立近视眼动物模型，研究近视眼的发病机制，以寻找有效的治疗手段。在眼球解剖上，雏鸡眼球与人眼球存在一些异同。鸡的巩膜分为外层的纤维层和内层的软骨层；而人眼球巩膜则无软骨层，仅有纤维层。鸡视网膜外颗粒层较人眼薄，无明显的视盘，而代之以称为“栉膜”的结构,鸡视网膜缺乏血管。除此之外，视网膜其余结构和脉络膜与人眼基本相似。另外，由于鸡与人的颌面部发育特征存在差异，导致双眼在面部的位置不同：鸡的眼球位于头面部的两侧；而人眼球位于头面部的正前方，这种解剖差异可能导致人眼比鸡眼更容易形成双眼单视功能。但雏鸡生长发育较快,生命及实验周期较短, 一生中眼屈光状态变化与人眼基本相似，来源丰富便利，价格低廉。鸡眼球的视觉正常发育与人眼相似，也受外界环境的密切影响：正常适量适时的光刺激；光线进入眼球后形成的焦点或焦平面与视网膜平面一致；甚至居住环境的高度、生活饮食习惯等都会对眼球正常的视觉发育起到重要的影响作用。且雏鸡作为较经典的动物模型，其技术与方法较成熟，已在基础研究领域应用很久。因此，我们选用雏鸡作为近视眼动物模型。目前常采用药物、离焦透镜、形觉剥夺、角膜激光屈光手术、晶状体摘除等方法诱导实验性近视眼的形成。我们利用半透明的眼罩遮盖实验眼，造成单眼全视野形觉的破坏，成功诱导和建立了雏鸡FDM动物模型，证明形觉剥夺可诱导后部巩膜向后生长延长，导致轴性近视眼。鸡FDM动物模型有其特异性：鸡的巩膜结构不同,除纤维层外并有软骨层，近视时主要是软骨层蛋白聚糖的合成增加，造成巩膜软骨层组织增多增厚，引起眼轴主动扩展[2,3]；任力濛等[4]研究也证实鸡FDM眼轴变长、眼球壁总厚度无明显变薄,提示FDM眼球代偿性生长加快可能是其眼球增大的原因之一,并非单纯扩张性膨大。本研究证实，正常雏鸡刚出生时呈远视状态，随时间远视度数逐渐减低，但至性成熟前期仍呈轻度远视状态。对刚出生的雏鸡实行形觉剥夺可诱导眼轴快速延长，出现高度近视状态，并随剥夺时间的延长，近视度数增加。可见从出生至性成熟前期，是视觉发育的关键时期，视觉的正常发育——正视化过程依赖于视网膜接受正常光刺激，形觉剥夺可导致眼轴延长，引起近视眼。
近视眼发病机制一直不明，因此严重制约近视眼的病因学。近来研究显示,神经递质VIP作为视觉信息分子，在视觉诱导的近视眼形成中可能起到重要的信息传递与调控功能。VIP属于小分子的神经多肽，是一种特殊类型的神经递质—神经肽递质，广泛分布于神经系统与消化系统。VIP与其受体结合后，主要通过cAMP依赖的蛋白激酶途径发挥生理作用。VIP与受体结合后，首先激活腺苷酸环化酶（AC），催化ATP转化为cAMP,cAMP随之激活cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）。PKA又可使细胞内多种蛋白质磷酸化，产生生理效应，尤其是在细胞的增殖分化中有重要作用，并抑制多种细胞因子的合成与分泌；在中枢神经系统，VIP不仅具有神经递质的作用，还兼有神经调质、神经激素释放因子和强大的神经营养作用[5]。VIP可促进神经干细胞向多种视网膜细胞的分化；刺激脉络膜和视网膜各种细胞的生长和分化；在视网膜色素上皮（RPE）培养中，VIP是调控cAMP信号途径的神经递质和调质中最有效的刺激物之一；VIP对分化和终末分化细胞内的PP60、酪氨酸活化酶起到有效的调控；刺激视网膜所有磷酸化作用和去磷酸化作用；刺激视网膜表面大分子分泌和从末端到RPE层基底面的轴浆转运能力的提高；促进脉络膜和RPE黑色素的生成。证明VIP是功能性视网膜发育期分化的促进因子[6-9]。
在以往的研究中，VIP在FDM中的表达与调控研究较少。Raviola等[10]和Stone等[11]证实单眼FD导致该眼形成轴性近视眼成为形觉剥夺性近视眼（FDM）；并用免疫组化的方法检测FDM的视网膜内丛状层的无长突细胞亚型中VIP的表达明显上调；但未检测VIP核酸转录水平表达的改变。本研究运用RT-PCR检测FDM中VIP在核酸转录水平的动态表达。研究结果显示VIPmRNA在雏鸡正常眼和FDM的眼球后壁均有丰富表达，且这一表达部位与一氧化氮合酶（iNOS）和TGF-β1表达部位[12,13]极其相似，可能的解释是表达VIP受体的细胞90%显示有神经源性一氧化氮合酶的定位[14]，这两种神经递质和TGF-β1在感光、视觉调控中均起到重要作用；单眼形觉剥夺可导致剥夺眼产生近视，其眼球后壁VIPmRNA表达明显上调，与对照眼差异显著。FDM中VIP在后部脉络膜、视网膜中表达丰富，广泛表达于视网膜内网层的第1、2亚层的无长突细胞的亚型，在该处VIP标记的无长突细胞的细胞突接受从其它无长突细胞和双极细胞轴突末端的突触输入；VIP免疫活性无长突细胞最常见的突触后靶目标是内网层1～3层的其它无长突细胞的细胞突，其次是双极细胞，神经节细胞的树突也是VIP免疫活性无长突细胞的突触后靶目标[15,16]。说明在FDM中VIP表达上调，作用于受体VIPR，可能影响视网膜内层信息传递回路，通过复杂的视网膜—脉络膜—巩膜调控机制，诱导相关近视信使最终作用于巩膜，导致巩膜主动重塑，产生近视眼，但其具体的调控途径还需进一步研究阐明。
【】
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