RP?HPLC法测定愈伤灵胶囊中阿魏酸的含量
作者：赵海霞 伟忠民 杨菁 王洪新 宿希武
【摘要】 目的： 建立RP?HPLC法测定愈伤灵胶囊中阿魏酸含量的方法。 方法： 采用Kromasil C18液相柱(200mm×4.6mm，5μm)，乙腈?0.085%磷酸溶液(17:83)为流动相，检测波长为316nm，流速为0.9ml/min。 结果： 阿魏酸在0.01~0.16μg范围内线性关系良好(r= 0.9999)，平均加样回收率为99.5%；测得愈伤灵胶囊中含有阿魏酸的含量为66.8μg/颗。 结论： 该方法专属性强，重复性好，可用于愈伤灵胶囊的质量控制。
【关键词】 愈伤灵胶囊； 阿魏酸； RP?HPLC法； 含量测定
愈伤灵胶囊由三七、红花、黄瓜子、土鳖虫、当归、续断、落新妇等7味药材组成。愈伤灵胶囊活血散瘀、消肿止痛，可用于跌打挫伤、筋骨淤血肿痛，亦可用于骨折的辅助。当归为方中君药，能补血活血、调经止痛、润肠通便，可用于风湿痹痛、跌扑损伤的治疗［1］。该制剂原标准中未能对该中药的成分进行质量控制。阿魏酸是当归中的指标控制成分，药理研究表明，阿魏酸具有抗血小板聚集、抑制血小板5?羟色胺释放、抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成、增强前列腺素活性、缓解血管痉挛等作用［2］，和该制剂的功能主治一致，故选定阿魏酸作为愈伤灵胶囊的定量指标进行质量控制。对该制剂中阿魏酸的含量进行了测定，结果表明该方法简便、准确、重现性好,可作为该制剂的含量测定和质量控制方法。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（Shim 10A，日本岛津）；色谱柱(Kromasil 200×4.6mm，5μm 瑞典)；紫外检测器（Shim DAD，日本岛津）；二元泵(Shim LC?10ATVP，日本岛津)；微量进样器(25μl，Hamilton 美国)； UV?Vis分光光度计（日本岛津）；微量分析天平(Mettler AE163 瑞士)等。阿魏酸对照品(药品生物制品检定所，批号：0773?200204)；愈伤灵胶囊(锦州奥鸿药业有限责任公司提供，0.3g/颗，批号：20050603、20050615、20050626)；乙腈 (色谱纯，美国FISHER公司)；二次蒸馏水；磷酸为分析纯。
2 方法和结果
2?1 色谱条件的选择选择Kromasil色谱柱为固定相，乙腈?0.085%磷酸溶液(17:83)为流动相；取阿魏酸对照品流动相溶液于200~400nm波长范围内进行全波长扫描在316nm处有最大吸收，故选择316nm作为检测波长；流速为0.9ml/min，进样体积10μl，理论塔板数（按阿魏酸）不小于5000。该条件下阿魏酸与其它组分均能达到基线分离，阴性对照样品在阿魏酸色谱峰的保留时间处无干扰。见图1。
A：阴性样品 B：愈伤灵胶囊 C：阿魏酸对照品
图1 测定愈伤灵胶囊中阿魏酸含量的HPLC色谱图（略）
2?2 对照品溶液的制备精密称取阿魏酸对照品适量，置于棕色量瓶中，加流动相使溶解并稀释至刻度后摇匀，避光低温保存，得到含阿魏酸40μg/ml对照品贮备液。
2?3 供试品溶液的制备取20颗愈伤灵胶囊，倾出药粉，研细，混匀，精密称取2.0g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入流动相溶液50ml，称定重量，加热回流1小时并放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀后静置，避光低温保存，取上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，得供试品溶液。
2?4 标准曲线绘制依次取阿魏酸对照品贮备液至10ml棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度，得浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/ml阿魏酸对照品溶液。按2.1项下色谱条件依次进样10μl。记录峰面积，以阿魏酸峰面积（Y）对阿魏酸进样量(X)进行回归，得回归方程：Y=5283128X-3524.5（r = 0.9999）。
2?5 精密度试验取同一浓度对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，每次10μl，依法测定峰面积的RSD=1.35%(n=6)，表明方法精密度较好。
2?6 重复性试验取同一供试品6份，分别精密称定，按2.3项下供试品溶液的制备方法配制溶液，按2.1项下色谱条件依法测定，每一样品测定3次。记录峰面积值，测定样品中阿魏酸的含量，样品中阿魏酸含量的RSD＝1.94%（n＝6），该方法重复性良好。
2?7 稳定性试验取同一供试品按2.3项下供试品溶液的制备方法配制溶液，避光放置，在24h内，按2.1项下色谱条件每隔4h进样，连续进样6次，每次10μl，依法测定，阿魏酸峰面积的RSD=1.62%(n=6)，表明供试液在避光条件下放置24h稳定性良好。
2?8 加样回收率试验准确称取已知阿魏酸含量的同一供试品1.0g，至100ml具塞锥形瓶中，分别加入2.2项下对照品贮备液(40μg/ml)4.5ml、5.5ml、6.5ml，加入流动相55.5ml、54.5ml、53.5ml按2.3项下供试品溶液的制备方法配制溶液，避光低温保存，按2.1项下色谱条件进样每次10μl，记录峰面积，测定阿魏酸的含量，平行操作2次，加样回收率为99.5%,RSD为1.32%。见表1。
表1 回收率试验（略）
2?9 样品的含量测定取样品粉末2 g，精密称定，按2.3项下供试品溶液的制备方法配制溶液，按2.1项下色谱条件依法测定，记录峰面积值，测定样品中阿魏酸的含量，结果如表2。由此得愈伤灵胶囊中阿魏酸的含量为66.8μg/颗。
表2 愈伤灵胶囊中阿魏酸的含量测定结果（略）
3 讨论
阿魏酸含量测定方法主要有薄层色谱法、薄层洗脱比色法、毛细管电泳法、薄层扫描法、高效液相色谱法［3］等。本研究建立的测定愈伤灵胶囊中阿魏酸含量的方法采用HPLC法，适用于当归药材及其复方制剂中阿魏酸含量的测定。由于阿魏酸不稳定，样品配制后置棕色瓶中于冰箱中保存［4］。本研究用流动相提取可以使供试品中阿魏酸提取完全；用流动相溶解可以减小溶剂对样品的干扰；也可以保证样品中阿魏酸峰的稳定性。试验表明，在该条件下，供试液在24h内稳定性良好。可以用本研究建立的HPLC法作为愈伤灵胶囊的质量控制方法。拟制定愈伤灵的质量标准：本品每颗胶囊中含当归按阿魏酸（C10H10O4）计不得少于60μg。
【】
1 中华人民共和国卫生部药典委员会. 药典?一部. 北京:化学出版社,2005，89.
2 黄瑾,胡晋红,朱全刚. 阿魏酸及其衍生物的药理作用. 中药材，2001,24（7）:57~61?
3 闵凡新,李文玉，等. HPLC法测定当归中阿魏酸的含量. 中草药，2004,35(3):332~333?
4 宋浩亮,罗华菲,官洪义. 阿魏酸及其制剂的稳定性研究. 安徽医药，2003,7(4):252~253?
