淫羊藿对小鼠免疫功能的调节作用
作者：熊平源 郭凯文 唐朝辉 白惠卿
【关键词】 淫羊藿；,,T淋巴细胞；,,IL
摘 要： 目的：探讨淫羊藿对小鼠免疫功能的调节作用。方法：采用 3HTdR标记法，测定淫羊藿对NK细胞毒活性的影响及淫羊藿对ConA诱导小鼠T淋巴细胞的转化活性影响；通过ELISA法测定淫羊藿对小鼠脾细胞产生IL2的影响；利用流式细胞术，检测淫羊藿对T淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD4 / CD8阳性细胞百分率的影响。结果：中、高剂量组均能增强NK细胞的细胞毒活性(P＜0.01）；中、高剂量组均能增强ConA诱导小鼠T淋巴细胞的转化活性(P＜0.01）；各剂量组均能增强脾细胞IL2的产生（P＜0.01）；各剂量组CD8阳性细胞百分率明显降低， CD4 / CD8阳性细胞百分率显著提高(P＜0.01）。结论: 淫羊藿对小鼠免疫功能有明显的调节作用。
关键词： 淫羊藿； T淋巴细胞； IL2； NK细胞
淫羊藿（Epimedium Kereanum Nakai）具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。淫羊藿药用悠久 ,来源于小檗科淫羊藿属的多种植物。李时珍在《本草纲目》中称其有“益精气、坚筋骨、补腰膝、强心力”之功效。药理实验研究表明 ,淫羊藿能增加心脑血管血流量 ,促进造血功能、免疫功能及骨代谢 ,具有抗衰老、抗肿瘤等功效。本研究通过小鼠NK细胞活性测定试验、淋巴细胞转化试验、IL2活性测定试验、流式细胞术测定试验等以进一步了解淫羊藿对小鼠免疫功能的调节作用。
1 材料
Ba1b/c品系小鼠，体重18~22g，雌雄各半，由北京大学医学实验动物中心提供。淫羊藿由中药店购置。ConA为Sigma公司产品，3HTdR由院原子能研究院同位素研究所提供，小鼠IL2 ELISA试剂盒为晶美生物工程有限公司产品。NK敏感细胞株Yac1细胞由北京大学医学部免疫学系提供。流式细胞仪：FACS Can 型，是美国BactonDickson 公司产品。
2 方法与结果
100%药液的制备：取干燥生药20g，加水100~200ml，置冰箱中24h，然后将水浸生药武火煮沸，并以文火煎煮，维持30min，用纱布粗滤，留滤液，再将残渣用水100~200ml煎煮30min，再滤除残渣。两次滤液合并，浓缩至20ml，即每ml含药量1g，调pH至7.4，再以1500rpm离心15min，取上清液备用[1]。小鼠随机分成5组，每组10只。正常对照组：每只每日用0.25ml生理盐水连续灌胃10d;造模对照组：给予 60CO照射造模，一次性 60CO γ射线400 rad全身照射，剂量率213.93伦/min，时间103 s[1];药物实验组：同等条件下一次性 60CO γ射线照射后药物I组给予淫羊藿1g /（kg.d）体重，连续灌胃10d;药物II组给予淫羊藿10g /（kg.d）体重，连续灌胃10d;药物III组给予淫羊藿50g /（kg.d）体重，连续灌胃10d[2]。
21 NK细胞活性测定试验取Yac1细胞和效应细胞悬液各50μl（效靶比为100:1），加入96孔培养板中，再加入0.1ml培养液,同时设效应细胞和靶细胞对照,置37℃5%CO2培养箱中培养6h。渗入0.5μCi/20mld的3HTdR，培养6h后收获。用多头细胞收集器将细胞收集于纤维素滤膜上，用蒸馏水反复冲洗，再滴加50.0g/L三氯醋酸2ml，使样品固定，无水乙醇2ml流洗脱色后，置于80℃烘箱内干燥30min。将烘干的滤膜放入盛有5ml闪烁液的测量杯中，置于液体闪烁仪中测Cpm值。每份样品设三个复孔[2,4,6]。结果见表1。
表1 淫羊藿对NK细胞活性的影响（略）
表1结果显示，不同浓度淫羊藿处理后的效应细胞与靶细胞共同培养6h后，药物Ⅱ组和药物Ⅲ组与造模对照组比较，NK细胞的细胞毒活性均明显增强（P＜0.01）。
22 淋巴细胞转化试验 将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾、剪碎、研磨、过滤，用含10%小牛血清的IMDM培养液制备脾细胞悬液，使细胞浓度为1×106个/ml。取100μl于96孔培养板中，加入10.0μg/mlConA，每孔终体积为200μl。37℃培养48h后加入 3HTdR 2μlCi/孔，继续培养12h后收获。用多头细胞收集器收集细胞于纤维素滤膜上，用蒸馏水反复冲洗后，再滴加50.0g/L三氯醋酸2ml，使样品固定，无水乙醇2ml流洗脱色后，置于80℃烘箱内干燥30min。将烘干的滤膜放入盛有5ml闪烁液的测量杯中，置于液体闪烁仪中测Cpm值。每份样品设三个复孔[3,6]。结果见表2。表2结果显示，不同浓度淫羊藿处理后的小鼠淋巴细胞与ConA共同培养48h后，与造模对照组比较，药物Ⅱ组和药物Ⅲ组均能明显增强ConA诱导淋巴细胞的转化活性（P＜0.01）。
23 IL2活性测定试验 取1×106个/ml浓度的小鼠脾细胞悬液100μl于96孔培养板中，加入10.0μg/ml ConA，每孔终体积为200μl。取上清冻存于-20℃。参照小鼠IL2 ELISA试剂盒，测定OD450值[2,5]。结果见表3。
表2 淫羊藿对淋巴细胞转化活性的影响 略
表3结果显示，不同浓度淫羊藿处理后的小鼠淋巴细胞在ConA刺激下产生IL2的能力，与造模对照组比较，药物I组、药物Ⅱ组和药物Ⅲ组均能明显增强ConA诱导淋巴细胞产生IL2的能力（P＜0.01）。
24 流式细胞术测定试验 取1×107个/ml浓度的小鼠脾细胞悬液100μl于小离心管中，分别加入FTTC标记的CD3，PE标记的CD4 、CD8抗体10μl，振荡混匀，室温下避光放置30min，用PBS洗涤2次，再加500μl PBS混匀，10min后用流式细胞仪检测CD3 、CD4 、CD8 、CD4 /CD8的阳性表达率[5]。结果见表4。
表4 淫羊藿对T淋巴细胞亚群的影响 略
表4结果显示，不同浓度淫羊藿处理后，能促进 60CO γ射线照射小鼠CD4/CD8 T淋巴细胞的恢复，增加CD4/CD8 T淋巴细胞比值。药物处理各组与造模对照组比较，P＜0.01。
3 讨论
NK细胞属于非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染靶细胞，在机体抗肿瘤和早期抗病毒和胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。在肿瘤或病毒特异性IgG抗体存在条件下，NK细胞还可通过表面IgGFCR介导，识别杀伤与IgG抗体特异性结合的肿瘤细胞或病毒感染的靶细胞。此外，NK细胞活化后，还可通过分泌IFNγ、IL2和TNF等细胞因子发挥免疫调节作用。因此，NK细胞具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等功能。表1结果显示，不同浓度淫羊藿处理后的效应细胞与靶细胞共同培养6h后，药物Ⅱ组和药物Ⅲ组与造模对照组比较，NK细胞的细胞毒活性均明显增强。T淋巴细胞表面表达有多种能结合丝裂原的膜分子，其结合丝裂原的特异性由糖基特点决定。与相应丝裂原结合后，可直接诱导静息T淋巴细胞活化、增殖和分化。表2结果显示，不同浓度淫羊藿处理后的小鼠淋巴细胞与ConA共同培养48h后，与造模对照组比较，药物Ⅱ组和药物Ⅲ组均能明显增强ConA诱导淋巴细胞的转化活性。IL2主要由活化的T淋巴细胞产生，可作用于多种免疫效应细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞等，并能诱导产生新型的杀伤细胞，如淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）。现已证明，T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞表面均表达IL2R，IL2可与其表面的IL2R结合而对这些细胞发挥免疫调节作用。表3结果显示，不同浓度淫羊藿处理后的小鼠淋巴细胞在ConA刺激下产生IL2的能力，与造模对照组比较，药物I组、药物Ⅱ组和药物Ⅲ组均能明显增强ConA诱导淋巴细胞的转化活性。特异性细胞免疫的效应细胞主要是Th1型的CD+4细胞和CD+8CTL细胞。前者经活化MΦ而诱生炎症性迟发型超敏反应，在宿主抗胞内病原感染中起重要作用；后者通过分泌细胞毒素及诱导细胞凋亡以带病原的靶细胞。表4结果显示，不同浓度淫羊藿处理后，能促进 60CO γ射线照射小鼠CD4/CD8 T淋巴细胞的恢复，增加CD4/CD8 T淋巴细胞比值，药物处理各组与造模对照组比较。本研究结果从通过检测小鼠NK细胞杀伤活性、淋巴细胞转化活性及IL2分泌活性和CD4/CD8 T淋巴细胞比值等证明了淫羊藿对小鼠免疫功能有增强作用和对免疫应答的调节作用，对开发利用淫羊藿这一天然药物具有实际意义。
参 考 文 献
1 陈国联，任茜，李强，等.16种药用忍冬的抗菌作用实验研究. 武汉冶医学报,1991,27（1）：1~4.
2 熊平源，郭明雄，张文仁，等. 三普虫草精对小鼠免疫功能影响的实验研究. 武汉冶金科技大学学报,1999,22（1）：92~95.
3 刘小雨，沈自尹，王奇,等. EF对老龄大鼠Th1、Th2、Th3细胞的调节作用. 免疫学杂志,2005,21（11）：842~845.
4 Kumagai K，Itoh K，Suzuki R， et al.Studies of murine large granular lymphocytes 1,identification as effector cells in NK and Kcytotoxicities. J Immunol，1982,129：88.
5 石磊，谭岩，刘志强,等. 虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用. 中国免疫学杂志,2002,18（11）：799~803.
6 刘杰麟，章灵华，钱玉昆. 枸杞多糖对S180荷瘤小鼠的免疫抑瘤作用.中国免疫学杂志,1996,12（2）：115~117.
