切除部分Ranvier 区对骺板软骨细胞 bcl-2和bax表达的影响
作者：张克勇 蔡 林 袁诚霞 陈方舟 汪 鹏
【关键词】 bax
摘 要: 目的:探讨凋亡相关基因bax、bcl-2在Ranvier 区部分切除后骺板软骨组织中的表达。方法:切除12mm长的新西兰大 耳白兔的胫骨近端Ranvier区，于术后1、4周处死实验兔，从免疫组化方面观察凋亡相关基因bax、bcl-2在Ranvier区部分切除后不同 周龄的兔胫骨近端骺板软骨组织中表达的变化特征。结果: 随着Ranvier区部分切除后， 骨桥形成前骺板软骨组织中的软骨细胞凋 亡率明显低于对照组，骨桥形成后软骨细胞凋亡率明显高于对照组。结论: Ranvier区和骨桥对骺板软骨细胞的凋亡率有促进作用， 骨桥的促进作用更明显。
关键词: bax; bcl-2; Ranvier区; 骺板
累及Ranvier区的损伤常导致骺板横向和纵向的发育紊 乱［1］ ，也有可能导致骨软骨瘤等骨肿瘤的发生 ［2］ ，Ranvier区 在骨发育中的作用越来越受到重视。Ranvier区的损伤对骺板 软骨细胞凋亡相关基因bax 和bcl-2的表达是否有影响，目前 仍然不清楚。因此， 本研究利用切除Ranvier区后的骺板软骨 作为研究模型，试图从骺板软骨组织的整体上了解bax及bcl- 2 在切除Ranvier区后的骺板软骨细胞增殖和凋亡过程中的表 达， 探讨bax及bcl-2 在切除Ranvier区后骺板软骨细胞凋亡 中的分子生物学机理。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作
选用封闭群系日本大耳白兔24只，兔龄5周，体重0.5～ 0.7kg，随机分为两个实验组，每组12只。两个实验组均采用 一侧胫骨近端骺板为实验部位，另一侧作对照组。1% 戊巴比 妥钠3ml/kg静脉麻醉，手术野常规消毒， 根据兔的解剖作各 实验侧膝前内侧直切口，长约3cm切开皮肤皮下组织，暴露胫 骨结节以上胫骨体前内侧面。暴露干骺端骺板骨软骨膜环， 于骺板上方1.5 mm 至下方1.0 mm处以小尖刀环形切除，厚 约0.5 mm、宽2～3mm、长度为12mm骨软骨膜。然后结扎止 血，逐层缝合组织。对照组暴露干骺端骺板骨软骨膜环后，不 作切除，全层缝合组织。分别于术后1、4处死实验兔，每次每 组处死6只。解剖出双侧胫骨。
1.2 检测方法及指标项目
1.2.1 组织学观察 新鲜标本在10%中性甲醛溶液中固定1 周，然后用10%EDTA室温下脱钙1月。冠状面纵行剖开，制 作成4μm 连续石蜡切片，HE染色染色。镜下观察骺板损伤 后的病理改变。
1.2.2 bcl-2 和bax表达检测方法 bcl-2、bax 单克隆抗体、SP 试剂盒均为武汉博士德生物技术公司产品。采用SP免疫组 化染色法，按照试剂盒的操作步骤进行。400 倍显微镜下分别 观察bcl-2 和bax蛋白的表达，并每10个随机高倍镜视野 中阳性细胞的表达率。 1.3 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件包进行统计，采用方差分析，检 验水准 α =0.05。
2 结果
2.1 骺板损伤后的病理演变 术后1周: RG切除区由开始纤维化的肉芽组织覆盖，骺 板外侧软骨细胞增生带明显增厚。有薄层骨质从二次骨化中 心紧贴骺板外缘向下爬行至骺板外侧软骨细胞增生带，肥大 带向下延长，骺板呈向下弯曲现象（图1A）。 术后4周: RG切除区由纤维结缔组织覆盖，骺板外缘的 骨质明显增厚，覆盖整个骺板，骺板外侧软骨细胞较一周时细 胞数量明显减少，并向下延续形成一条由增生、肥大及钙化软 骨细胞组成的软骨带（图1B）。
2.2 bcl-2 蛋白的表达结果 bcl-2蛋白在细胞内为胞浆表达， 光镜下呈现棕黄色颗 粒， 正常细胞表达程度较强而凋亡细胞表达程度较弱或不表 达。本实验1W切除组bcl-2 蛋白表达的细胞数量多，颜色深， 呈强表达（图2A）;对照组则表达细胞数少， 且色泽浅，呈弱表 达（图2B） ; 1W切除组的阳性表达率为41.53%， 对照组的 阳性表达率为32.46%，两者的差异具有显著性（ χ 2 =14.32，P <0.05） 。4W切除组的表达程度弱于对照组（图2C，D） 。
2.3 bax 蛋白的表达结果bax蛋白在细胞内表达部位及表达形态、色泽与bcl-2 蛋 白相同，但表达强度和意义有所区别， 即正常细胞表达程度 通常较弱或不表达而凋亡细胞表达程度较强。本实验1W切 除组细胞数表达且色泽浅， 呈弱表达（图3A）;对照组表达细 胞数量多， 颜色深， 呈强表达（图3B） 。1W切除组的阳性表 达率为30 .44 % ，对照组的阳性表达率29.02% ，两者的差 异不具有显著性（ χ 2 =8.64 ， P >0. 05）。4W切除组的表达 程度强于对照组（图3C，D）。 表1 两组骺板软骨bcl-2和bax的RNA表达阳性率比较
3 讨论
早在1873年Ranvier 曾描述了骨骺板周围有一个环形切 迹3］ ，该区包含三个不同的细胞群［4 ，最内层有一组密集成团 的细胞，它们和骺生长板增生层上部的软骨细胞大约在同一 水平，系胚胎的原始细胞演变成能生成骨皮的前骨母细胞，骨 钙素（BGP）免疫组化定位染色阳性 ［5］，细胞核癌基因蛋白 myc、jun免疫活性呈阳性 ［6］ ，具有成骨特性及非常活跃的增 生、分裂和/或迁移的活性。该层细胞生成的骨皮除对骺板有 机械支持作用外［7、8］，是否对骺板软骨细胞的凋亡有影响，目 前仍不清楚。 与骺板软骨细胞的凋亡有关的基因中，bcl-2是体内细胞 重要的抗凋亡基因之一 ［9］。 bcl-2抑制细胞凋亡，在免疫调节 中发挥重要的作用，其高表达可阻遏细胞凋亡，延长细胞寿 命，促进细胞生存。bax是bcl-2 的同源基因， 其过度表达可 拮抗bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。在体内bcl-2家族 的成员通常以bcl-2/bax二聚体的形式发挥作用，两者的比值 决定了细胞对凋亡信号敏感性。当bcl-2/bax升高，表示细胞 对凋亡信号敏感性减弱，呈现抑制凋亡作用。两者的比例决 定细胞的生死，如bcl-2过量，形成bcl-2二聚体，那么细胞就 存活;如bax过量，形成bax二聚体，细胞就会凋亡［10］ 。本实验首次观察到，随着Ranvier区部分切除后，凋亡相 关基因bcl-2、bax在骺板软骨中的表达具有数量积累的趋势。 首先，骨桥形成前在靠近Ranvier区切除部分，骺板软骨细胞 凋亡率明显低于对照侧，bcl-2表达明显增高而bax表达差异 不具有显著性，同时，骺板软骨基质表现出相应的增生，同一 骺板的Ranvier区相对未切除侧骺板软骨细胞凋亡率较对照 侧没有明显差异。说明骺板软骨细胞凋亡率的改变与局部细 胞或炎性因子有关。其次，骨桥形成后软骨细胞凋亡率明显 高于对照侧，切除组较对照侧bcl-2表达降低而bax表达增高， 其软骨细胞凋亡率明显增高，说明骨桥引发骺板软骨细胞凋 亡，引起bcl-2与bax表达改变。 研究表明参与软骨细胞的凋亡进程的细胞因子中，目前 研究较多的NO、PGE2、TNF -α、IL-l等炎性因子多抑制软骨细 胞增殖，促进软骨细胞的凋亡。仅甲状旁腺激素相关肽（para- thyroid hormone-related peptide ， PTHrP）等既抑制软骨细胞凋 亡，又促进软骨基质表现出相应的增生，其作用最符合本实验 的观察结果。故认为PTHrP在Ranvier区部分切除后， 骺板 软骨细胞相应的凋亡率变化中，具有重要意义。Amling等 ［11］ 的研究则显示PTHrP可以上调bcl-2的表达，并指出这一作用 可能是PTHrP抑制细胞分化和凋亡的机制所在。PTHrP选择 性抑制col-Ⅹ的合成，合成col-Ⅹ是软骨细胞分化成熟的标 志，提示PTHrP可抑制软骨细胞成熟过程 ［12］ 。PTHrP又可显 著刺激软骨基质-蛋白多糖的合成 ［13］ 。PTHrP促进软骨细胞 增殖及合成软骨基质同时其分化成熟的机制尚未完全明确根 据本实验的观察结果，可以认为Ranvier区内层细胞生成的骨 皮除对骺板有机械支持作用外，尚具有屏障作用，参与Ihh/PTHrP负反馈环路［14］ ，在骺板软骨细胞增生层上部的水平上， 阻断PTHrP等细胞因子对软骨细胞增殖及软骨基质合成的促 进作用，防止软骨细胞过度增殖所致的软骨发育不全，在保持 骺板的生理发育过程中具有重要作用。其具体机制有待进一 步研究。
参 考 文 献
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