MTT法分析含药血清对体外培养肺癌细胞增殖的影响

           作者：赵婷秀 陈振发 邱幸凡 由江峰 许湘 王秀莲 姜霞 刘凌琪

【关键词】  莪术瓜蒌汤

　　摘 要:  目的:MTT法观察莪术瓜蒌汤含药血清对人肺癌细胞增殖的影响。方法:家兔灌胃制备高、中、低剂量莪术瓜蒌汤血清  分别作用于人肺癌细胞，采用MTT法观察莪术瓜蒌汤含药血清对细胞增殖的抑制作用。结果:高剂量血清组与对照血清组之间的吸  光度差异有显著统计学意义（ P <0.01），随着作用时间的延长，其吸光度逐渐降低，抑制率逐渐增高。结论:莪术瓜蒌汤含药血清具  有一定的抗肺癌作用，并存在一定的量效关系，为莪术瓜蒌汤的临床应用提供了的实验依据。  

　　关键词:  莪术瓜蒌汤; 人肺癌细胞; 血清药; MTT法

　　为进一步研究中医药肺癌的作用机理，本实验采用  MTT法观察莪术瓜蒌汤含药血清对人肺癌细胞增殖的影响，  筛选出合适的血清浓度。  

　　1  材料和方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  人肺癌细胞系 人肺巨细胞癌（pulmonary giant cell   carcinoma，PG）的低转移亚系LH7（PGLH7）    ［1］    由北京大学医  学部病理系提供。

　　1.1.2  主要试剂及设备 RPMI 1640（美国GIBCO），胰蛋白  酶（美国SIGMA）;噻唑蓝（美国SIGMA）;二甲基亚砜（北京北  化精细化学公司）。高速低温离心机（美国SIGMA）;超净工  作台（北京半导体设备一厂）;CO    2   恒温孵育箱（法国Jouan）。

　　1.2  实验方法 

　　1.2.1  药物制备及剂量 莪术瓜蒌汤（简称“莪瓜汤”）由莪  术、天龙、沙参、全瓜蒌、龙葵组成，购于湖北中医学院附属医  院。将上述中药饮片置煎煮容器内，加水浸泡，煮沸，过滤浓  缩，用蒸馏水倍比稀释成含生药2.10g/ml、0.70g/ml、0.23g/  ml的水煎剂，分别作为高、中、低剂量灌胃药液。根据“人和动  物体表面积折算的等效剂量比率表”    ［2］    ，本实验所选具体剂量  为:家兔用药量（g.kg    -1    .d    -1    ）=人日用剂量×0.07/1.5 （g.  kg    -1    .d    -1    ）。莪术瓜蒌汤剂量标准为3.50 （g.kg    -1    .d    -1    ）。中  剂量:为上述标准剂量;高剂量:为标准剂量的3倍;低剂量:  为标准剂量的1/3倍。 

　　1.2.2  含药血清的制备 健康家兔16只（湖北中医学院动  物房提供），雄性，体重1.8 kg～2.0 kg。随机分成4组:空白  对照组、莪瓜汤低剂量组、莪瓜汤中剂量组及莪瓜汤高剂量  组。给药前禁食10～12 h，不禁水。各组家兔于每日早、晚各  灌胃给药一次，每次2.5ml/kg，共2次。按通法方案制备含药  血清    ［3］    ，实验分组:对照兔血清组、莪瓜汤低剂量血清组、莪瓜  汤中剂量血清组、莪瓜汤高剂量血清组、ATRA血清组。同组   血清混合，56℃水浴中灭活30min，用0.22μm的微孔滤膜过  滤除菌，置-20℃保存备用。

　　1.2.3  人肺癌细胞的培养 PGLH7细胞株，用含10%热灭活  新鲜小牛血清的RPMI 1640于37°C、5% CO    2   孵育箱中培养。  生长旺盛的细胞每2天传代一次。

　　1.2.4  MTT法检测癌细胞生长抑制率 用胰酶消化细胞，用  常规培养基配成细胞悬液种入96孔板，板周边的孔不加细  胞，防止有边缘效应。留空白孔调零，以只加培养液不加细胞  作空白对照。在37℃、5% CO    2   的培养箱内培养24 h后，分别  加入不同剂量的含药血清和对照血清。每组设4个平行孔，  继续培养24h，加入MTT溶液20ul继续培养4 h，终止培养，弃  培养液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150ul/孔，  振荡，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度 A 值，比色时以空  白孔调零。按照上述同样方法检测培养48 h、72 h的 A 值。  根据公式细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=（空白对照  组 A值-实验组A值）/空白对照组A 值×100%。 

　　1.3  统计学分析  数据处理采用方差分析。 

　　2  结果   10% 的含药血清作用PGLH7细胞24h、48h和72h的吸  光度值见表1。  由表1可以看出:莪术瓜蒌汤低、中剂量血清组与对照血  清组之间的PGLH7细胞吸光度差异无统计学意义，而莪术瓜  蒌汤高剂量血清组则与对照血清组之间的吸光度差异有显著  统计学意义（ P <0.01）;同时可以看到高剂量血清组随着作用  时间的延长，其吸光度逐渐降低，抑制率逐渐增高，但无统计  学差异。上述结果提示，10% 莪术瓜蒌汤高剂量血清组对  PGLH7细胞的增殖可能具有明显的抑制作用，并有随时间延  长而作用愈明显的趋势。  表1 莪术瓜蒌汤含药血清作用不同时间对PGLH7细胞增殖的影响注:* 与同一时点对照血清组比较， P <0.01。

    3  讨论

  “莪术瓜蒌汤”是名老中医邱幸凡教授肺癌的主要方  剂，是根据“痰瘀浊气凝结于肺”的病理特点而立法、组方、用  药的，临床治疗肺癌取得了一定疗效。中药复方多数是通过  口服而起作用的，用中药粗制剂直接加入离体反应体系中进  行实验研究，在方法学上存在很多问题，如中药中的杂质成  分、各种电解质或鞣质、以及不同酸碱度的影响等，都会对实  验结果造成一定的影响。中药血清药实现了体外实验和  体内实验的较好结合，在方法学上具有创新性，可以排除以上  各种因素的影响，比较接近药物体内环境中产生药理效应的  过程，目前是研究中药药理学的一种较为理想的方法    ［4］    。为  了减少因种属差异而造成的免疫反应，实验动物应尽量选用  与人类生物学特性近似的物种，以家兔和大鼠为首选。李仪  奎等    ［3］    提出中药血清药理研究的通用给药方案（通法）并给出  增大给药剂量以部分地弥补含药血清被稀释，较好地控制实  际加入反应体系中含药血清的药量。在体外培养体系中宜采  用同种单一血清，且含药血清在培养液中的浓度一般不能超  过20%，其中以10%的浓度为最佳条件。  MTT显色法    ［5］    是近几年评价肿瘤细胞生存状态较受推崇  的方法之一。当肿瘤细胞在光镜下尚未出现明显外形变化  时，其活细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶可还原MTT而形成难  溶的蓝紫色结晶物，死细胞则无此功能。用酶联免疫检测仪  测定其吸收值在一定数量的细胞范围内，间接反映活细胞的  数量。MTT法反映不同肿瘤细胞对各种抗肿瘤药物的敏感性  差异，而且与其它药敏方法及临床疗效都有很好的相关性，对  于临床合理用药、实现肿瘤病人个体化治疗具有重要价值。  为了研究不同剂量含药血清对吸光度的影响，本实验选  用家兔制备莪术瓜蒌汤含药血清，以家兔的临床等效用药剂  量为中剂量，其1/3倍和3倍分别为低、高剂量，然后按通法  方案，以上述三种剂量分别给家兔灌胃给药，制备浓度为10%  的不同剂量含药血清。结果表明，不同剂量的莪术瓜蒌汤血   清组处理PGLH7细胞不同时间后，癌细胞的生长受到不同程  度的影响，其中高剂量莪术瓜蒌汤血清组对于人肺癌细胞的  增殖抑制作用明显优于其它各组含药血清，并与其药物剂量  呈正相关。我们认为在制备中药含药血清时适当增加临床等  效用药剂量是必要的。王力倩等    ［6］    在研究苦参、仙鹤草的抗  癌作用时显示，以临床常用量给药剂量所制得的含药血  清对肿瘤细胞体外生长有抑制作用，而比该药量小1倍的含  药血清则无明显作用。本实验也显示高剂量含药血清组对  PGLH7细胞的作用显著。所谓低、中、高剂量含药血清是指以  给予相应剂量的药物制得的血清，绝不应与由一种剂量的药  物制备的血清予以相应稀释的浓度高低相混淆，因为两者是  截然不同的两个概念。但我们也应看到，在中药含药血清的  制备过程中，由于受到动物选择、给药剂量、采血时间以及含  药血清的灭活、除菌、保存等诸多因素的影响，血清中所含的  确切药效成分尚未十分明了，其方法在技术上尚需探讨、规范  和完善。为研究中药血清对体外人肺癌细胞的药理作用，最  佳血清浓度还有待多方面验证。

　　参 考 文 献 

　　1 朱伟勇，郑杰，方伟岗，等.具有不同转移潜能的肺癌细胞亚系的分  离鉴定. 中华病理学杂志，1995，24:136～138. 

　　2 陈奇，主编.中药药理研究方法学.第一版.人民卫生出版社，2000，   145～146.

　　3 李仪奎.中药血清药理学实验方法的若干问题.中药新药与临床药  理，1999，10（2）:95～98. 

　　4 赵婷秀，陈振发.中药血清药理学方法的研究现状. 湖北中医学院  学报， 2003，5（3）:45～46.

　　5 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and surival ap-  plication to proliferation and cytotoxicity assays . Immunol Methods，   1983，65:55.

　　 6 王力倩，余上才，李仪奎.用血清药理学方法研究中药苦参、仙鹤草  的抗肿瘤作用.中医药科技，1995，2（5）:19～22.