Rac1在HL-60细胞中的表达及其对细胞周期和凋亡的影响
作者：高广勋，陈协群，张永清，白庆咸，黄高昇，张伟平，梁蓉
【摘要】 本研究旨在观察Rac1在急性白血病细胞系HL-60中mRNA的表达水平及其对细胞周期和凋亡的影响。采用半定量RT-PCR方法检测HL-60细胞及正常人外周血单个核细胞（PBMNC）中Rac1 mRNA表达水平；用脂质体FuGENE6法将 Rac1特异性反义寡核苷酸（ASODN）转入HL-60细胞，应用MTT试验检测细胞存活率；采用流式细胞术（FCM）检测细胞周期变化、Wright-Giemsa 、吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）及Annexin Ⅴ - FITC/PI染色检测凋亡细胞。结果表明：Rac1 在HL-60细胞系中相对含量（Rac1/GAPDH）为0.84±0.13，在正常PBMNC中相对含量为0.26±0.1（P <0.01），Rac1在HL-60细胞中的表达明显高于PBMNC。与正义链（SODN）组相比，经2.0 g/L Rac1特异性 ASODN作用48小时后，HL-60细胞存活率降低〖（73.7±5.0）% vs（93.2±3.0）%，P<0.01 ］，G1期细胞百分数升高〖（52.1±6.8）% vs （31.6±4.7）%，（P<0.05）］，Annexin Ⅴ阳性率升高〖（19.2±2.1）% vs (4.1±1.7)%，（P<0.01）］，凋亡小体明显增加。结论：白血病细胞系HL-60中高表达的Rac1可能促进白血病细胞HL-60的过度增殖并抑制其凋亡。
【关键词】 急性白血病
Rac1 Expression and Its Effects on the Cell Cycle Progression and Apoptosis in Human Acute Leukemic Cell Line HL-60
Abstract The study was aimed to investigate the expression of Rac1 in human acute leukemic cell line HL-60 and effect of Rac1 on cell cycle progression and apoptosis. The mRNA expression of Rac1 in HL-60 cell line and normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) were examined by semi-quantitative RT-PCR. After transfection of HL-60 cells with different concentrations of Rac1 antisense oligodeoxynucleotide （ASODN） by means of FuGENE6，the survival，cell cycle，apoptosis of HL-60 cells were observed through MTT assay，FCM test，Wright-Giemsa，acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) and Annexin Ⅴ-FITC/PI staining test respectively. The results showed that Rac1 relative amount in HL-60 was 0.84±0.13，while it in the normal PBMNC was 0.26±0.1 （P<0.01）；the expression of Rac1 in HL-60 cells was significantly upregulated. Compared with sense oligodeoxynucleotide (SODN)，HL-60 cell viability，after exposure to ASODN at a concentration of 2.0 g/L decreased，（73.7±5.0）% vs（93.2±3?0）% (P<0.01)，while the proportion of G1 cells increased as （52.1±6.8）% vs （31.6±4.7）% (P<0.05)，the percentage of Annexin Ⅴ positive cells increased，（19.2±2.1）% vs (4.1±1.7)% (P<0.01)，and HL-60 cells were observed to have formation of apoptotic bodies. The data presented indicate that Rac1 may be involved in regulation of HL-60 cell cycle and apoptosis，promote overproliferation of HL-60 cells and inhibit their apoptosis.
Key words Rac1；acute leukemia；apoptosis；cell cycle；HL-60 cell
Rho家族GTPase参与细胞骨架重组、信号转导与调控，从而影响细胞的极性、黏附、生长和运动。Rac是Rho家族的成员之一，有Rac1、Rac2、Rac3三种形式［1-4］。Rac1的诸多功能虽得到深入的研究，但其在白血病细胞中的表达及其对白血病细胞增殖与凋亡的影响国内外报道甚少。本试验拟通过观察Rac1在HL-60细胞中mRNA水平及Rac1特异性反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞生长、细胞周期和凋亡的影响，进一步证实Rac1与白血病细胞生物学特性之间的关系。
材料和方法
主要试剂
Taq酶购自大连TaKaRa公司，反转录试剂盒购自Promega公司，RNA提取试剂TRIzoL购自Invitrogen公司，脂质体FuGENE6购自Roche公司，MTT(四唑蓝)购自Sigma公司。
引物及寡核苷酸（ODN）设计合成
Rac1及内参照3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的PCR引物参照〖5］设计，并经过blast进行同源性分析。Rac1的上游引物为5′-AGGAAGAGA AAATGCCTG-3′，下游引物为5′-AGCAAAGCG TACAAAGGT-3′，长度为80 bp；GAPDH的上游引物为5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′，下游引物为5′-TGGCATGGACTGTGGTCATGAGTC-3′，其产物长度为525 bｐ。寡核苷酸的设计合成：选择与Rac2、 Rac3同源性小、位于启动子附近区域的20个碱基序列设计合成，正义链（SODN） 5′-GCTTCCTATCTCAGCGCCCT-3′，反义链(ASODN) 5′-AGGGCGCTGAGATAGGAAGC-3′，全硫代磷酸化修饰。ODN及引物均由上海Sangon公司合成。
半定量RT-PCR
各取1×106个健康成人志愿者外周血单个核细胞（PBMNC）及HL-60细胞提取总RNA。总RNA定量、逆转录反应合成cDNA均按试剂盒说明书进行，cDNA产物-20℃保存或即用。PCR反应采用50 μl反应体系，Rac1和GAPDH的退火温度分别设定为51℃和61℃，循环数为28个循环，2%琼脂糖凝胶电泳，用软件Genesnap对凝胶电泳条带照相，软件Genetools行灰度值分析，以目的条带与内参照条带的比值（Rac1/GAPDH）代表目的基因mRNA相对水平。
细胞培养和MTT实验
急性粒细胞白血病细胞株HL-60由第四军医大学病理教研室惠赠，培养于含体积分数为10%热灭活胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养液中，在37℃、5% CO2条件下传代培养，实验用细胞均处于指数生长期。MTT实验设ASODN组、SODN组及对照组，实验组ODN的终浓度分别设为0.5、1.0、2.0 g/L，对照组以完全RPMI 1640培养液培养细胞，HL-60细胞悬液200 μl（2×104/ml浓度，无血清RPMI 1640培养液）接种于U型96孔板（Costar），每浓度设平行孔3个，以FuGENE6介导的ODN转染按说明书以3∶1〖FuGENE6 (μl)∶ODN (μg)］比例进行混合，逐滴加入细胞悬液中，转染6小时后补加FBS，使其终浓度为10%，孵育48小时后每孔加入5 g/L MTT 20 μl，4 小时后离心弃上清，每孔加入150 μl二甲亚砜（DMSO），平板振荡仪振荡10分钟，采用酶标仪测定A490 nm值，细胞存活率（处理组A490 nm /阴性对照组A490 nm）。
细胞形态学观察及流式细胞术
倒置显微镜下观察培养细胞，收集细胞，PBS洗2次，调整细胞浓度1×107/ml，一部分细胞涂片，用冷丙酮固定5分钟，常规瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态；另一部分，滴加吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）染液（AO、EB各4 μg/L），10分钟后荧光显微镜下观察细胞形态并摄像，用AO/EB双染法来鉴定观察凋亡细胞［6］。每组收集1×106个细胞，离心洗涤，加入1 ml PBS和2 ml无水乙醇固定过夜，检测前离心除去酒精，用200 μl PBS稀释，加入DNA-Prepstain染液染色后，用EPICSXL-MCL流式细胞仪(Coulter公司)检测各组细胞的荧光强度，用DNA Multi Cycle软件进行统计学拟合分析，得到各个组细胞周期时相，每组样品重复3次。每组另收集1×106个细胞，加入结合缓冲液490 μl，混匀，加PI染液10 μl，Annexin V-FITC染液5 μl，37℃孵育10分钟，上流式细胞仪检测Annexin V阳性率。实验重复3次。
统计学处理
用SPSS 11.0软件进行处理，实验结果以均数标准差表示(x±SD)，采用t检验及方差分析。
结 果
Rac1在HL-60及PBMNC中的表达水平
RT-PCR结果显示Rac1在HL-60细胞及PBMNC中均有表达；灰度扫描分析表明Rac1在HL-60细胞中相对含量(Rac1/GAPDH)为0.84±0.13，在PBMNC中相对含量为0.26±0.1（P<0.01），这说明Rac1在HL-60细胞中的表达明显高于PBMNC（图1）。
ASODN对细胞存活率的影响
当采用浓度为0.5、1.0、2.0 g/L ASODN作用48小时后，HL-60细胞存活率分别降至（80.3±3.8）%、（78.3±3.5）%及(73.7±5.0)%，显著低于SODN组（95.1±4.1）%、（94.4±3.8）%及(93.2±3.0)%（P<0.01）。ASODN对细胞的增殖有明显的抑制作用，且具有一定的剂量依赖性。
ASODN对HL-60细胞周期的影响
HL-60细胞经2.0 g/L ASODN 作用48小时后，经流式细胞仪检测结果显示：ASODN组细胞的G1期百分数（52.1±6.8）%明显高于SODN组（32.8±3.9）%和对照组（31.6±4.7）%（ P<0.05）。而SODN组与对照组间无显著差异(P>0.05)，这提示经特异性ASODN处理的HL-60细胞周期发生G0/G1期阻滞(图2)。
ASODN诱导HL-60细胞凋亡
HL-60细胞经2.0 g/L ASODN 作用48小时后，部分细胞体积缩小，胞核固缩、碎裂，凋亡小体形成。流式细胞仪检测表明ASODN组AnnexinⅤ阳性细胞（19.2±2.1）%，明显高于SODN组(3.9±1.2)%和对照组 (4.1±1.7)%（ P<0.01），提示Rac1 ASODN可诱导HL-60细胞凋亡 (图3)。
讨 论
Rac亚家族中Rac1的功能成为近期研究的热点。Rac1基因位于人染色体7p22。Rac1的表达参与细胞骨架重组、信号转导调控等功能在实体瘤中的作用曾有一些初步的研究［1-4］，但其在白血病细胞中的表达与作用还未见报道。本实验采用了半定量RT-PCR观察HL-60细胞表达水平，采用内参照GAPDH及Rac1均未达到平台期的28个循环为PCR反应循环数，以PBMNC作为对照，观察白血病细胞和正常外周血单个核细胞之间的差异。实验显示，Rac1在HL-60细胞中及PBMNC中均有表达，且HL-60细胞mRNA表达水平明显高于PBMNC。但由于PBMNC多趋于成熟，增殖能力减弱，而HL-60细胞增殖能力较强，Rac1表达可能与细胞的活性及增殖能力有关。近期在造血干/祖细胞及B淋巴细胞发育和功能的研究中发现在细胞增殖发育、细胞信号转导、细胞骨架重组及基因转录调控等方面，Rac1起到了重要的作用［7，8］。为了进一步证明Rac1在白血病细胞中的作用，本实验采用特异性反义寡核苷酸探讨Rac1与HL-60细胞生存及凋亡的关系。结果发现，Rac1特异性ASODN作用后的HL-60细胞生长得到抑制，细胞存活率下降，G1期细胞比例增高，呈现G0/G1期阻滞。这一结果支持Gu等的观点，即Rac1通过调节细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）来调节细胞G1/S期进程［7］。据此，我们推测Rac1维持HL-60细胞较高的增殖活性及抑制其凋亡可能涉及cyclin D1与 MAPK活性的调控。
【】
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