PLK-1在急性白血病细胞中的表达及意义
作者：毛汉文，刘文励，周剑峰，孙汉英，徐惠珍，罗小华
【摘要】 为了探讨急性白血病细胞中plk-1基因及其蛋白的表达情况和意义，并初步了解PLK-1蛋白在急性白血病细胞中的分布情况，通过抽取急性白血病患者、骨髓良性增生者及正常人的骨髓或外周血单个核细胞作为研究对象,应用RT-PCR技术及流式细胞术检测plk-1 mRNA和PLK-1蛋白在急性白血病细胞中的表达，用荧光显微镜观察PLK-1蛋白在急性白血病细胞中的分布。结果表明：急性白血病细胞plk-1在基因水平及蛋白质水平上表达均明显增高；荧光显微镜检查显示细胞分裂间期PLK-1蛋白较高浓度地、均匀地散在分布于急性白血病细胞内，在有丝分裂过程中，姊妹染色单体拉开至细胞两极时PLK-1蛋白主要分布在姊妹染色单体之间。而正常骨髓细胞和良性增生骨髓细胞plk-1在基因水平和蛋白质水平几乎均不表达。结论： PLK-1蛋白对急性白血病细胞的异常增殖可能起重要作用，其表达的高低与恶性程度有关。PLK-1蛋白或其基因有可能作为抗瘤药物新的靶点，并可作为判断急性白血病疗效及预后的有效指标之一。
【关键词】 急性白血病； plk-1基因； PLK-1蛋白；急性白血病细胞； 基因表达
Expression of plk-1 Gene in Acute Leukemia Patients and Its Significanc
AbstractTo investigate expression of plk-1 gene and PLK-1 protein in acute leukemia patients and its clinical significance, and to observe the distribution of PLk-1 protein in acute leukemin cells, the mononuclear cells were separated from the bone marrow or peripheral blood of acute leukemia patients, bone marrow benign proliferation individuals and normal individuals. The expression of plk-1 gene and PLK-1 protein in those cells were detected with RT-PCR and flow cytometry respectively, the distribution pattern of PLK-1 was observed by fluorescent inverted microscope. The result showed that the expressions of plk-1 gene and PLK-1 protein in mononuclear cells of acute leukemia patients were much higher than that of bone marrow benign proliferation individuals and normal individuals. Fluorescent inverted microscopy revealed that PLK-1 was highly concentrated in cytoplasm of acute leukemia cells during interphase of mitosis, and it was found that PLK-1 was mainly distributed between sister chromatid during the mitosis in mononuclear cells of acute leukemia patients, but the expressions of plk-1 gene and PLK-1 protein almost were not observed in cells of benign proliferative bone marrow and normal bone marrow. It is concluded that increased plk-1 gene and protein perhaps play an important role in abnormal proliferation of acute leukemia cells and correlate with the malignamcy of leukemia. plk-1 gene or PLK-1 protein may be considered as a new target of therapy, and one of useful indicators in evaluation of curative effeciency and prognosis.
Key wordacute leukemia; Plk-1 gene; PLK-1 protein; acute leukemia cell; gene expression
肿瘤的发生、与细胞周期的紊乱有关，polo-样激酶-1（polo-like kinase-1, PLK-1）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,主要参与染色体纺锤体的形成及分配,它对细胞周期的正常进行、中心体功能成熟、胞质分裂起监控调节作用［1,2］。PLK-1在实体瘤细胞中呈现高表达并且对肿瘤的发生、发展起重要作用［ 3］，而在急性白血病发病中的表达情况鲜有报告。为此我们进行了实验，旨在研究plk-1基因在急性白血病细胞中的表达情况，并探讨其在急性白血病进展中的意义。
材料和方法
临床病例
急性白血病组为2003年11月—2004年10月在我院血液科住院患者，根据临床特点、细胞形态学、组织化学及细胞免疫表型检查， 符合FAB诊断标准的急性白血病37例。年龄12-65岁，（男性 21例，女性 16例）。初发25例,复发12例。骨髓24份，外周血13份。在37例中急性非淋巴细胞白血病(ANLL)22例（M1 4例, M2 6例，M3 5例，M4 4例，M5 3例）；急性淋巴细胞性白血病(ALL) 15例 。
骨髓良性增生组18份骨髓(BM)/外周血(PB) 标本，来自我院同期住院患者，年龄18-57岁（男性 10例，女性 8例），其中重症肺炎10例,急性肾盂肾炎4例,亚急性细菌性心内膜炎2例，肺脓肿2例 ，其外周血WBC>10×109/L, 骨髓增生明显活跃, 原始及幼稚细胞均小于5％。
正常组11份骨髓（骨髓移植供者及胸科手术过程切除的肋骨中抽吸的骨髓）
材料及仪器
淋巴细胞分离液购自深圳晶美生物工程有限公司； PLK(F-8)一抗为美国Santa Cruz生物技术公司产品；FITC荧光二抗购自北京中山生物技术公司；RT(逆转录)试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司； TRIZOL液购自上海华舜生物工程有限公司；PCR试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司；流式细胞仪为FACS420型，美国Becton-Dickinson 公司产品，倒置相差显微镜（XDS-1型）为重庆光学仪器厂产品。
方法
RT-PCR 扩增将肝素抗凝的骨髓/外周血3 ml用密度梯度离心法分离单个核细胞。按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA ，用紫外光分光光度计测定RNA浓度及纯度。引物设计：采用GeneFisher 1.3软件设计引物：Plk-1(455 bp)正义链：5＇-CTC CTG GAG CTG CAC AAG AGG AGG AA-3＇； 反义链 ：5＇-TCT GTC TGA AGC ATC TTC TGG ATG AG-3＇，内参照为GAPDH(604 bp)。 按RT-PCR试剂盒说明书步骤合成相应plk-1的DNA产物，并进行琼脂糖凝胶电泳。
流式细胞术检测将肝素抗凝的骨髓/外周血3 ml用密度梯度离心法分离单个核细胞。然后将分离的骨髓或外周血单个核细胞约106/ml用2％多聚甲醛(含0.1％ Trition-100) 4℃固定，依次加入封闭抗体(小牛血清白蛋白) 4℃静置30分钟。然后滴加1∶100稀释的PLK-1特异抗体, 4℃孵化30分钟，再加入1∶50 FITC荧光抗体, 4℃孵化30分钟。在流式细胞仪上样分析，用细胞的平均荧光强度表示单个细胞PLK-1的相对表达量。每例样品测定10 000个细胞。
荧光显微镜观察将分离的单个核细胞滴片,置37℃干燥箱烘干，应用2％多聚甲醛(含0.1％TRITON-100)4℃固定30分钟,加入封闭抗体(小牛血清白蛋白),37℃孵化30分钟。滴加1∶100稀释的PLK-1特异抗体, 4℃孵化过夜，然后滴加1∶50 FITC荧光抗体, 在PBS湿盒中避光 4℃孵化30分钟，加PI稀释液37℃孵化5分钟复染染色体，甘油封片。尽快用荧光显微镜观察。
统计学分析
数据以均数±标准差（±SD）表示，采用SPSS 统计软件进行t检验。P<0.05视为有显著性意义。
结果
RT-PCR 扩增
RT-PCR 检测结果显示,37例急性白血病细胞中均可扩增出plk-1 mRNA中的1个片段，其条带较亮（如图1中的lane 4所示，长度为455 bp）。而正常细胞及骨髓良性增生细胞中plk-1 mRNA扩增的条带较暗（分别如图1中lane 5、lane 1所示）。内参照GAPDH(604 bp)亦被扩增（如图1中lane 2所示）。将各组细胞plk-1 mRNA扩增的条带与内参照的灰度值相比较，结果为急性白血病细胞的plk-1 mRNA表达显著增高，而在正常细胞和骨髓良性增生细胞中plk-1表达较低（表1）。Table 1. Expression of plk-1 mRNA in mononuclear cells of bone marrow or peripheral blood （略）
流式细胞术检测
流式细胞术检测各组标本显示，急性白血病组细胞、骨髓良性增生组细胞和正常组细胞的PLK-1蛋白平均表达量分别为20.37±3.566、 3.070±0.398和2.250±0.435。各组间比较，急性白血病组PLK-1蛋白的表达明显高于骨髓良性增生组及正常组，而骨髓良性增生组与正常组比较无明显差异（表2，图2、3、4）。Table 2. Expression of PLK-1 in mononuclear cells of bone marrow or peripheral blood detected by flow cytometry
（略）
荧光相差显微镜观察
通过荧光相差显微镜对各组细胞观察，发现急性白血病细胞中PLK-1蛋白呈现较强的绿色荧光（表达增强），同时还发现在白血病细胞有丝分裂过程中，PLK-1蛋白在两个子细胞之间集中分布（图7、8，绿色所示）。PLK-1蛋白在正常细胞及良性增生细胞中几乎未现（无绿色荧光，图5，6）。以上提示plk-1蛋白在急性白血病细胞中呈高表达，而在正常细胞及良性增生细胞中呈低表达。
讨论
我们通过RT-PCR技术及流式细胞术检测发现，在急性白血病细胞中PLK-1高表达,而在良性增生及正常骨髓中均低表达，这说明PLK-1具有较高的肿瘤特异性。通过荧光显微镜观察发现，正常细胞中PLK-1未见表达（无绿色荧光），良性增生骨髓细胞中也几乎未见PLK-1表达，在急性白血病细胞分裂间期，PLK-1散在分布于急性白血病细胞的胞浆内；分裂期，姊妹染色单体拉开至细胞两极时PLK-1主要分布在姊妹染色单体之间。以上结果可能提示： PLK-1蛋白的高表达与急性白血病细胞的有丝分裂、肿瘤细胞的增殖有关。有报告，对HeLa细胞在其细胞周期的不同阶段进行抗PLK-1抗体细胞内微注射，检测发现该细胞的分裂明显受阻［4］。这一现象也提示PLK-1在急性白血病细胞的异常增殖过程中起重要的作用。PLK-1可能是通过其激活酶活性使CDC25扩增环(amplification loop)中丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化而顺次激活细胞周期中M期激酶［5,6］。近来发现针对plk-1 mRNA反义寡核苷酸进行干预，能特异性地抑制PLK-1的丝氨酸/苏氨酸激酶活性， PLK-1水平的下降相应地改变了肿瘤的细胞周期［7］。因而，PLK-1及其基因有望成为急性白血病最佳靶点之一，这是我们进一步研究的方向之一。综上所述,PLK-1在正常骨髓及良性增生活跃骨髓中低表达，在急性白血病中高表达，具有较高的肿瘤特异性。急性白血病细胞PLK-1的特异性表达将作为判断急性白血病细胞预后、诊断、疗效的指标之一，同时为寻找有效的抗瘤药物靶点提供了一种途径。
【文献】
1 Lane HA, Nigg EA. Antibody microinjection reveals an essential role for human polo-like kinase 1(PLK-1) in the functional maturation of mitotic entrosomes. J Cell Biol,1996; 135(6 Pt 2):1701-1713
2 Golsteyn RM, Mundt KE, Fry AM, et al. Cell cycle regulation of the activity and subcellular localization of PLK1,a human protein kinase implicated in mitotic spindle function. J Cell Biol,1995; 129:1617-1628
3 Ahmad N. Polo-like kinase(PLK)1: a novel target for the treatment of prostate cancer. FASEB J, 2004; 18:5-7
4 Compton DA. New tools for the antimitotic toolbox. Science, 1999; 286(5441):913-914
5 Cheng L,Hunke L,Hardy CF. Cell cycle regulation of the saccharomyces cerevisiae polo-like kinase cdc5p. Mol Cell Biol,1998; 18:7360-7370
6 Jackman M, lindon C, Nigg EA, et al. Active cyclin Bl-Cdkl first appears on centrosomes in prophase. Nat Cell Biol, 2003; 5:143-148
7 林莉，王升启，管伟等. Plk-1基因为靶的反义寡核苷酸对HepG2肝癌细胞的体内外抗肿瘤作用. 癌症,2001; 20：1233-1236.
