HLA-A*0201-BSP融合基因的构建与原核表达
作者：孙万军， 杜建芳，徐东刚， 邹民吉， 王金凤， 蔡欣， 王颖， 王嘉玺， 艾辉胜
【摘要】 克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体，以制备HLA-A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从已鉴定为HLA-A*0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA-A*0201重链胞外区的基因，拼接上依赖生物素-蛋白连接酶（biotin-protein ligase，BirA）的可生物素化序列（BirA substrate peptide，BSP），构建HLA-A*0201-BSP的原核表达载体，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果表明：成功扩增出HLA-A*0201-BSP融合基因并测序证实，构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大肠杆菌DH5α中高效表达HLA-A*0201-BSP融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的28%，以包涵体的形式表达，经洗涤、变性后，以Sepharcyl S-300 HR（S-300）柱层析纯化，纯度可达90%以上。结论：获得了高效表达HLA-A*0201-BSP的大肠杆菌工程菌株，建立了简便有效的包涵体纯化方法，为制备HLA-A*0201-肽四聚体奠定了基础。
【关键词】 HLA-A*0201； HLA-A*0201-BSP融合基因； HLA-A2四聚体； 可生物素化序列
Cloning and Expression of HLA-A*0201-BSP
AbstractHigh-yield production of HLA-A*0201 heavy chain is a prerequisite to the preparation of HLA-A2 tetramer. The present study was aimed to construct the expression vector of recombinant HLA-A*0201-BSP fusion gene for preparing HLA-A2 tetramers. The extracellular region HLA*0201 was cloned by RT-PCR from HLA-A2+ donor, and a 15-amino acid biotin-protein ligase (BirA) substrate peptide (BSP) for BirA-dependent biotinylation was added to the COOH-terminus of HLA-A*0201 heavy chain. Then the fusion gene was cloned into pBV220 vector at EcoRⅠ and Bam HⅠ sites and its sequence was confirmed by DNA sequence analysis. The recombinant plasmid pBV220-HLA-A*0201-BSP was transformed to the competent cells of E.coli DH5α. The results showed that the HLA-A*0201-BSP fusion protein was successfully expressed in the form of inclusion body and amounted to over 28% of total cell proteins via induction at 42℃. After washed with triton X-100 and urea, the inclusion body was dissolved with 8 mol/L urea and then purified with Sepharcyl S-300 HR, and the final purity reached above 90%. It is concluded that the HLA-A*0201-BSP fusion gene was cloned successfully and expressed efficiently in E.coli DH5α. This work establishes a convenient approach for purification of large quantity of recombinant HLA-A*0201-BSP. This provides the basis for the preparation of HLA-A2 tetramers.
Key wordsHLA-A*0201; HLA-A*0201-BSP fusion gene; HLA-A2 tetramers; BirA substrate peptide
主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ类分子分布在所有有核细胞的表面，其作用是将细胞内经过加工的抗原肽呈递到细胞表面，并充当T细胞受体（TCR）识别抗原肽的限制性分子。在抗原呈递细胞表面的MHC-Ⅰ类分子与抗原肽组成的复合物被TCR识别后，抗原特异性CD8+ T细胞在共刺激分子的辅助作用下被激活，发生细胞增殖并分泌细胞因子，进而在机体抗肿瘤、抗感染及抗移植物等免疫反应中发挥重要作用。1996年，Altman等［1］首创的
MHC-肽四聚体技术正是基于对这一体内识别过程的体外模拟，获得了对抗原特异性CD8+ T细胞的精确定量，成为定量检测抗原特异性T细胞的金标准。本研究应用基因工程技术，在成功克隆了HLA-A*0201重链胞外区基因后，将依赖生物素-蛋白连接酶（biotin-protein ligase， BirA）的可生物素化序列（BirA substrate peptide， BSP）连接到其胞外区末端，构建成融合表达载体，在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达，并对获得的融合蛋白进行了纯化，为进一步制备抗原特异性的HLA-A*0201四聚体奠定了基础。
材料和方法
材料
大肠杆菌E.coli DH5α和质粒pBV220均为军事医学院基础医学研究所基因工程研究室保存。TRIZOL试剂、RT-PCR试剂、限制性内切酶EcoRⅠ和Bam HⅠ、 T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Gibco BRL公司。Sephacryl S-300 HR（S-300）胶为Pharmacia公司产品。尿素、二硫苏糖醇等为进口或国产分析纯试剂。
方法
HLA-A*0201基因型健康人白细胞总RNA抽提及cDNA合成取HLA配型检查鉴定为HLA-A*0201基因型的健康成年志愿者肝素抗凝静脉血2 ml，按常规方法以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，以TRIZOL试剂提取总RNA，直接进行逆转录反应。反应体积为20 μl。首先在6 μl DEPC水中加入2 μg总RNA，10 μmol/L Oligo（dT）1 μl，在70℃变性5分钟后置冰浴。再加入5×反应缓冲液4 μl，2.5 mmol/L dNTP混合物2 μl， RNasin 40 U，及AMV逆转录酶10 U，42℃反应1小时后，于85℃温育5分钟终止反应，合成的cDNA即可用于PCR扩增或存-20℃。RNA完整性以1%琼脂糖凝胶电泳及扩增管家基因GAPDH进行验证。
HLA-A*0201重链胞外区基因的PCR扩增根据IMGT/HLA 数据库中的HLA-A*020101的cDNA序列设计引物。上游引物P1为： 5'-GC GAATTC ATG GGC TCT CAC TCC ATG AGG TAT TTC-3'，含起始密码子，EcoRⅠ识别位点。下游引物P2为： 5'- T GAG GGG CTT GGG CAA ACC-3'。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。该对引物扩增出的片段为HLA-A*020101重链胞外区基因1-811碱基序列。PCR反应在20 μl体积中进行，以0.5 μl cDNA第一链为模板，反应条件为在94℃变性5分钟，然后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸40秒，共进行32次循环后，于72℃延伸7分钟。获得的PCR产物称为A2'。
融合BSP序列的HLA-A*0201重链胞外区基因的重叠延伸PCR扩增为在HLA-A*020101重链胞外区（成熟蛋白序列1-276氨基酸）羧基端连接可生物素化序列（BirA substrate peptide，BSP）（LHHILDAQKMVWNHR），设计的引物P3如下： 5'-CG GGATCC TTA ACG ATG ATT CCA CAC CAT TTT CTG TGC ATC CAG AAT ATG ATG CAG AGA GCC CGG CTC CCA TCT CAG GGT GAG GGG CTT GGG CAA ACC-3'，其中包含HLA-A*020101重链胞外区基因812-828碱基、编码Gly-Ser接头和BSP的DAN序列，以及终止密码子、Bam HⅠ识别位点。重叠延伸PCR反应在20 μl体积中进行，以0.5 μl上述获得的PCR产物A2' 为模板，仅加入1 μl引物P3，在94℃变性5分钟，然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，共进行8次循环；之后，在上述反应体系中加入引物P1，在94℃变性3分钟，然后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸40秒，共进行25次循环；再于72℃延伸7分钟。获得的PCR产物即为HLA-A*0201-BSP融合基因片段。
HLA-A*0201-BSP融合表达载体的构建及测序鉴定质粒提取、酶切、连接、转化和鉴定等，均按Sambrook实验手册［2］进行。将扩增的HLA-A*0201-BSP融合基因片段回收后，以EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切，与经相应酶切后的质粒pBV220连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂板，挑克隆及小量扩增后，以碱裂解法提取质粒，双酶切法筛选接入HLA-A*0201-BSP融合基因的转化子，提交上海博亚生物技术有限公司进行测序。
HLA-A*0201-BSP在E.coli中的表达、包涵体洗涤、溶解和纯化将含阳性重组质粒的E.coli DH5α接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养过夜，然后以1%的比例转接，30℃培养至OD600值为0.6-0.8时，转入42℃水浴摇床中诱导4小时，离心收集菌体，以20 mmol/L Tris-HCl（pH 8?0，含100 mmol/L NaCl、 1 mmol/L EDTA、 1 mmol/L DTT）重悬，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，其中沉淀部分（包涵体）以20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0，含100 mmol/L NaCl、 1 mmol/L EDTA、 1 mmol/L DTT和2% Triton X-100）洗涤2次，以2 mol/L 尿素洗涤1次，再以8 mol/L 尿素变性溶解，以S-300为柱填料，对溶解上清液进行凝胶过滤层析，洗脱液为20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0，含8 mol/L尿素，100 mmol/L NaCl），上样体积为柱体积的2%，流速控制为0.5毫升/分钟，用自动收集器分管收集洗脱液，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定各管组份。
SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%，以考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。
结果
HLA-A*0201-BSP融合基因的PCR扩增
根据IMGT/HLA数据库中的HLA-A*020101的cDNA序列设计引物P1、P2，以HLA-A*0201基因型的健康人白细胞总RNA逆转录第一链cDNA为模板进行PCR反应，扩增出一条与预计大小（822 bp）相符的DNA片段（图1）。该DNA片段为HLA-A*020101重链胞外区基因1-811碱基序列。
又以上述获得的PCR产物A2'为模板，以引物P1、P3经重叠延伸PCR扩增出1条与预计大小（901 bp）相符的DNA片段（图2）。该DNA片段可编码HLA- A*020101重链胞外区1-276氨基酸和BSP，并编码两者间的Gly-Ser接头。
HLA-A*0201-BSP融合表达载体的构建及鉴定
经PCR扩增出的长度为901bp的DNA片段经EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切后，与同样酶切的pBV220连接，转化DH5α，筛选接入目的基因的阳性克隆（图3），经测序证实插入序列为含起始密码ATG，且正确编码HLA- A*020101重链胞外区1-276氨基酸和BSP的基因，与IMGT/HLA数据库中公布的HLA-A*020101序列、Altman等［1］报道的BSP序列完全一致。构建的表达载体称pBV220-HLA-A*0201-BSP。
HLA-A*0201-BSP在E.coli中的表达和纯化
将构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP质粒转化E.coli DH5α，得到含重组质粒的基因工程菌。E.coli DH5α表达的HLA-A*0201-BSP的SDS-PAGE图见图4。SDS-PAGE分析表明，该工程菌在未诱导前无外源蛋白表达，经42℃热诱导4小时后，可表达相对分子量约34 kD的外源蛋白，该外源蛋白分子量与预期理论值一致，经薄层灰度扫描分析，外源蛋白的表达量占菌体总蛋白的28%。而转入pBV220空载体的E.coli DH5α在相同分子量部位无明显蛋白条带。菌体经破碎后分为上清和沉淀，可见重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分。沉淀部分经洗涤、尿素溶解后，进行S-300柱层析纯化，目的蛋白纯度可达90%以上，平均收率为10?6%。
讨论
MHC-Ⅰ类分子是由具有高度多肽性的重链和保守的轻链,即β2-微球蛋白组成的异源二聚体。在抗原呈递细胞（APC）内合成的抗原短肽，即结合于由MHC-Ⅰ类分子重链的α1和α2结构域构成的肽结合槽内，而β2-微球蛋白（ β2M）与重链的α3结构域的非共价结合使MHC-Ⅰ类分子-肽复合物更加稳定，最终定位于细胞表面，并通过与抗原特异性的CD8+ T细胞表面的TCR相互作用使之激活，进而杀伤靶细胞。如果在体外制备MHC-肽复合物，模拟APC/特异性靶细胞表面MHC呈递的多肽复合物，通过与体内T细胞的TCR特异性结合，就可达到直接检测抗原特异性T细胞的目的。但可溶性的MHC-肽复合物单体与TCR结合的亲和力很低、解离速度快。MHC-肽四聚体技术则克服了这一难题，其精巧之处在于利用基因工程技术获得MHC-Ⅰ类分子重链时，在其羧基端融合1段由15个氨基酸组成的BirA酶依赖的可生物素化序列（BSP），从而可以利用BirA酶在BSP序列内的赖氨酸残基上接一个生物素分子［3］。在此融合蛋白与β2m、抗原肽折叠成可溶性MHC-肽单体分子后，即可对其生物素化。利用1分子链亲和素可结合4分子生物素的性质，进一步与荧光标记的链亲和素结合，便可获得均一的四聚体。结合流式细胞术，即可用于抗原特异性T细胞的定性和定量分析［4,5］。为制备HLA-A*0201-肽四聚体，首先需克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区。之所以选择HLA-A*0201，是因为汉族群体中此基因频率在Ⅰ类分子中最高，超过30%的个体表达此分子［6］。目前对MHC-肽单体的生物素化主要采取BirA酶对可识别序列（BSP）的生物素化和化学试剂生物素化两种模式［7］。本研究亦采取了在HLA-A*0201的重链胞外区羧基端融合BSP序列的策略来实现生物素化目的。在进一步的实验中，我们又探索了对HLA-A*0201的重链胞外区实施化学试剂生物素化的模式，也获成功（另文发表）。选择合适的载体-宿主系统是外源基因在原核体系内高效表达的关键之一。本研究选用了含有PRPL启动子的表达载体pBV220构建融合表达载体pBV220-HLA-A*0201-BSP，主要是考虑该载体为温控型表达载体，相对于需使用异丙基硫代-β -D半乳糖苷（IPTG）进行诱导的表达载体（如pET系列载体等）而言，其诱导方法简便、成本低廉，且目的蛋白表达稳定。这对于制备大量纯化的目的蛋白以构建HLA-A*0201-肽四聚体无疑是具有相当优势的。在转化至pBV220最适宿主菌E.coli DH5α 诱导后发现，目的蛋白主要存在于包涵体中，表达量约占菌体总蛋白的28%。形成包涵体使目的蛋白免受胞内酶的降解作用，易于以高纯度和高浓度方式分离。在获得HLA-A*0201-BSP包涵体后，经洗涤、尿素溶解，以S-300柱层析纯化，即可获得较高纯度（＞90%）的重组蛋白，方法简便，完全满足制备四聚体的需要。因此，无需为了纯化方便而在HLA-A*0201-BSP的C端融合His6标签［8］，且末端引入外源氨基酸，从而可能对折叠形成HLA-肽复合物单体造成影响，使最终获得的四聚体特异性发生改变。通过原核表达获得的HLA-A2重链分子本身无生物学活性，也不能单独在复性中获得正确的构象。只有在β2-M、抗原肽均存在的前提下才能复性，并与之折叠形成正确的HLA-A2单体构象［9］。本研究获得的纯化HLA-A*0201-BSP重组蛋白，纯度为90%，浓度达2 mg/ml，可直接用于制备HLA-A2四叠体。本研究成功克隆了HLA-A*0201的重链胞外区基因，构建的HLA-A*0201-BSP融合表达载体在大肠杆菌DH5α 中可高效表达目的蛋白，为进一步制备抗原特异性的HLA-A*0201四聚体奠定了基础。
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