β-连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达及其意义
作者：陈胜梅，孙慧，刘延方，张秋堂
【摘要】 为了探讨β-连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达及其意义，应用流式细胞术和免疫组织化学染色两种方法，检测了20例初治急性白血病患者骨髓细胞β-连环蛋白的表达水平，同时用免疫组织化学染色方法检测了上述细胞的细胞增殖指数Ki-67的表达水平。结果表明：与对照组相比，β-连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达明显升高（P<0.05），并出现由胞浆向胞核转位； Ki-67在急性白血病骨髓细胞的表达也明显升高（P<0.05），β-连环蛋白的表达与Ki-67的表达有明显的正相关(Pearson相关系数r=0.845)。结论：β-连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达明显增高，并与细胞增殖有关，提示β-连环蛋白可能通过促进细胞异常增殖参与急性白血病的发病。
【关键词】 急性白血病
Expression and Role of β-catenin in Acute Leukemia Bone Marrow Cells
Abstract The aim of this study was to explore the expression of β-catenin in acute leukemia bone marrow cells and its role in the development of acute leukemia. The expression of β-catenin of bone marrow cells was detected by immunocytochemistry and flow cytometry in 20 cases of newly diagnosed acute leukemia. Meanwhile the expression of the proliferating index Ki-67 was detected by immunocytochemistry. The results showed that the expression of β-catenin and Ki-67 in acute leukemia bone marrow cells was significantly higher than those in control group (P<0.05). The migration of β-catenin from cytoplasm to nuclear was observed in acute leukemia bone marrow cells. There was a positive correlation between the expressions of β-catenin and Ki-67 in all the cases and the Pearson correlation coefficient was 0.845. In conclusion， the expression of β-catenin was significantly high in acute leukemia bone marrow cells and showed a positive correlation with the cell proliferation. It suggests that β-catenin may be involved in the development of acute leukemia through promoting the excessive proliferation of cells.
Key wordsβ-catenin; the acute leukemia; Ki-67; cell proliferation
白血病的发生是一个多基因参与、并受多种因素影响的复杂过程。近年来，许多细胞内信号转导分子和基因转录调节因子在白血病发病机制中的作用受到重视。β-连环蛋白（β-catenin）是新近发现的一种信号分子，参与多种信号转导，在细胞增生、组织修复、胚胎发育及癌症的发生过程中发挥重要作用［1］；Ki-67是一种核增殖抗原，出现于除G0以外的G1、S、G2和M期的细胞周期中，是判断细胞增殖活性的一种特异性标志［2］。本研究应用流式细胞术和免疫组织化学染色方法检测了急性白血病骨髓细胞中β- catenin和Ki-67的表达，探讨了其在急性白血病发病机制中的意义。
材料和方法
研究对象及标本处理
经细胞形态学、组织化学和细胞免疫学确诊的急性白血病患者20例，其中ALL患者8例，ANLL患者12例。骨髓涂片大致正常的非恶性血液病患者10例作为对照。在无菌条件下按照常规操作穿刺，抽取骨髓1 ml，肝素抗凝，用0.01 mol/L PBS 1∶1稀释，以淋巴细胞分离液（Ficoll，密度1.077）按常规方法分离骨髓单个核细胞，并调整细胞浓度为1×107/L。流式细胞术检测
细胞经4%多聚甲醛固定10分钟，0.1% Triton-X100通透10分钟，每个步骤后用PBS洗涤3次，调整细胞浓度为1×107/L备用。取2支试管，1管为参照管，加有PBS；另1管为试验管，加有FITC结合的β-catenin单克隆抗体（为美国Becton Dickinson公司产品，1∶20稀释），各取100 μl细胞悬液加入2管，室温避光孵育30分钟，PBS洗涤3次后用流式细胞仪检测骨髓细胞β-catenin的表达水平。
免疫组织细胞化学检测
细胞涂片后用4%多聚甲醛固定10分钟，0.1% Triton-X100通透10分钟，用体积分数为3％的过氧化氢溶液室温孵育10分钟，用羊血清正常封闭，室温孵育15分钟，分别加鼠抗人β-catenin单克隆抗体（北京中山公司产品，1∶50稀释）和鼠抗人Ki-67单克隆抗体（美国Becton Dickison公司产品，1∶50稀释），置4℃过夜，滴加生物素标记羊抗小鼠二抗，37℃孵育10分钟，辣根过氧化物酶标记链酶卵白素，37℃孵育10分钟，每步之间均用PBS洗涤，最后经DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每一批实验均设有阳性和阴性对照，阳性对照用胃癌石蜡切片，阴性对照以PBS代替一抗。
结果判定
流式细胞术
在未设门的情况下以FITC-β-catenin为横坐标，细胞数为纵坐标，对骨髓细胞表达β-catenin的状况进行分析，由于细胞结合抗体的多寡与其荧光强度相关，故以平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）表示细胞表达β-catenin蛋白分子的多少。
免疫组织化学检测法
参照1997年全国免疫组织化学技术诊断标准化专题研讨会意见，细胞胞浆胞核着棕黄色者为阳性细胞，根据阳性颗粒所占的比例及显色程度，对阳性细胞进行记分：1分——阳性颗粒所占细胞面积的比例<50％，细胞浆和（或）核内见浅黄色颗粒，明显高于背景底色；2分——阳性颗粒所占细胞面积的比例为51％-70％，细胞浆和（或）核内见较深黄色颗粒；3分——阳性颗粒所占细胞面积的比例>70％，细胞浆和/或核内见大量深黄色颗粒，浆和（或）核有时可被颗粒掩盖而不显。每片统计500个细胞中的阳性细胞数及总细胞记分，阳性率=阳性细胞数/500×100%，平均记分=总细胞记分/500。
统计学处理
经SPSS (10.0版)统计软件进行统计学分析，统计数据用“均数±标准差”（X±D）表示，急性白血病组和对照组的比较采用独立样本t检验，β- catenin和Ki-67的表达相关性分析采用二元变量的相关分析（Pearson相关系数）。以α=0.05为显著性检验水准。
结果
β-catenin在骨髓单个核细胞的表达
免疫组织化学染色方法检测结果 β-catenin在对照组骨髓单个核细胞的表达大部分细胞呈阴性表达，少部分呈弱阳性，仅见胞浆弥散浅黄着色且着色不均匀；在急性白血病患者骨髓单个核细胞中，β-catenin在胞浆和胞核的表达呈强阳性，以胞核表达为主，仅有极少数细胞呈阴性表达，两组间的表达有明显的差异性（P<0.05）（表1，图1）。Table 1. Expression of β-catenin in acute leukemic cells by immunocytochemical assay（略）
流式细胞术检测结果 考虑到免疫组织化学染色结果主观性较强的因素，我们同时应用流式细胞术检测了β-catenin的表达，排除参照不同的客观影响后，无论急性白血病组还是对照组，都未能检测到其胞膜的表达，而经过透膜处理后，进一步用抗β-catenin单克隆抗体染色后用流式细胞仪检测，β-catenin在急性白血病骨髓细胞的表达显著高于对照组（P<0.05）（表2，图2）。Table 2. Expression of β-catenin in acute leukemia bone marrow cells by flow cytometry in MFI（略）
Ki-67在骨髓单个核细胞的表达
Ki-67在急性白血病骨髓单个核细胞的表达与对照组相比有明显的增强（P<0.05）（表3），但两者阳性细胞的表达强度均显示高低不等。Table 3. Expression of Ki-67 in acute leukemic cells by immunocytochemical assay（略）
β-catenin与Ki-67表达的相关性
β-catenin与恶性肿瘤的发生有关，Ki-67反映了细胞的增殖状态，分析β-catenin与Ki-67在急性白血病表达的相关性结果显示两者呈明显的正相关，Pearson相关系数r= 0.845。在急性白血病中，β-catenin表达高时，Ki-67的表达也有增高的趋势（图3）。
讨论
β-catenin是一种多功能的蛋白质，具有参与细胞黏附和介导信号转导的双重功能，并与肿瘤的发生发展及浸润密切相关。在正常个体中，β-catenin和钙黏蛋白形成复合体，介导同型细胞的黏附，维持细胞的稳定［3］；同时，β-catenin作为Wnt/β-catenin信号通路的关键成员在介导信号转导过程中调控细胞的增殖和凋亡［4］。而在恶性肿瘤中，β-catenin的表达呈现明显的异质性，促使细胞异常增殖，还可使细胞之间的黏附性减弱，侵袭性增强［5，6］。
β-catenin在上皮起源肿瘤中的作用已基本明确，而对其在血液系统恶性疾病中的作用研究并不多见。Chung等［7］的研究显示：在白血病细胞系中β-catenin的表达水平有明显异质性，在T-ALL、Jurkat、Molt-4、SuDHL4和SuDHL5中β-catenin高水平表达，而在HL-60细胞系中β-catenin表达水平很低。由于细胞系的特性与活体内白血病细胞已有不同，Jamieson等［8］研究了β-catenin在正常人和CML患者（分为慢性期，加速期，急变期）造血干细胞和骨髓前体细胞的表达，结果显示：和慢性期相比，β-catenin在CML的加速期和急变期的骨髓细胞核中总表达明显增加。本研究在前两者的基础上直接以急性白血病病人骨髓白血病细胞为对象，进一步探讨β-catenin在急性白血病中的作用。在急性白血病的骨髓细胞中，β-catenin的表达明显高于对照组并出现由胞浆向胞核内的转位和胞核内的积聚，这一结果提示β-catenin在白血病的发病中起作用。
Ki-67作为一种核增殖抗原，由于其出现于除G0以外的G1、S、G2和M期的细胞周期中，并在有丝分裂后迅速裂解或失去抗原决定簇，能较可靠地全面反映细胞群体的增殖活性，是判断细胞增殖活性的一种客观指标和特异性指标［2］。在急性白血病的骨髓细胞中，Ki-67的表达与正常人相比有明显的增高，并且β-catenin表达高的细胞伴随有Ki-67的表达增高。
国外的进一步的研究发现，抑制β-catenin的活化转录后，低表达β-catenin的HL-60细胞生长增殖及集落形成能力不受影响，但高表达β-catenin的Jurkat细胞的生长增殖及集落形成能力受到抑制［7］；并且在anti-Fas、星形孢菌素（staurosporin，通过PKC相关机制诱导凋亡）、重组可溶性TRAIL（活化膜TRAIL受体诱导凋亡）和拓扑异构酶Ⅱ相关药物依托泊苷作为凋亡诱导剂处理Jurkat细胞后，在诱导的细胞凋亡过程中，β-catenin被剪切、裂解，表达水平降低［9］。从目前的研究结果推测，β-catenin的异常表达使细胞的增殖明显增强，而细胞凋亡受到抑制。在急性白血病的发病机制中，β-catenin可能通过促使白血病细胞异常增殖参与了急性白血病的发生和发展。
【】
1Maretto S，Cordenonsi M，Dupont S，et al. Mapping Wnt/ β-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Pro Natl Acad Sci USA，2003; 100: 3299-3304
2Borre M，Bentzen SM，Nerstrom B，et al. Tumor cell proliferation and survival in patients with prostate cancers followed expectantly. J Urol，1998; 159:1609-1614
3Hazan RB，Norton L. The epidermal growth factor receptor modulates the interaction of E-cadherin with the actin cytoskeleton. Biol Chem，1998; 273: 9078-9082
4Olmeda D，Castel S，Vilaro S，et al. β-catenin regulation during the cell cycle: implications in G2/M and apoptosis. Mol Biol Cell，2003; 14: 2844-2860
5Jones LJ，Veale RB. Redistribution of beta-catenin in response to EGF and lithium signalling in human oesophageal squamous carcinoma cell lines. Cancer Cell Int，2003; 3: 13-20
6Kikuchi A. Regulation of beta-catenin signaling in the Wnt pathway. Biochem Biophys Res Commun，2000，268:243-248
7Chung EJ，Hwang SG，Nguyen P，et al. Regulation of leukemic cell adhesion，proliferation，and survival by β-catenin. Blood，2002; 100: 982-990
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9Hwang SG，Lee HC，Trepel JB，et al. Anticancer drugs- induced apoptotic cell death in leukemia cells is associated with proteolysis of β-catenin. Leuk Res，2002; 26: 863-871
