姜黄素对人多发性骨髓瘤细胞表达Survivin、Bcl?2、Bax的影响
作者：刘波, 白庆咸，陈协群，高广勋，顾宏涛
【摘要】 为探讨姜黄素对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的抑制生长和诱导凋亡的作用机制，应用MTT法检测姜黄素对肿瘤细胞的杀伤效应；用流式细胞术(FCM)分析姜黄素作用后肿瘤细胞凋亡及细胞周期的变化；用RT?PCR方法检测Survivin、Bcl?2、Bax mRNA水平的变化。结果表明： 姜黄素明显抑制RPMI8226细胞的增殖，并表现为时间、剂量依赖性，24、48小时IC50值分别为12.15 μmol/L、4.9 μmol/L；凋亡率由10.6%增加到36.9%(p<0.05)，细胞发生G2/M期阻滞； RPMI8226细胞细胞强表达Survivin、Bcl?2，弱表达Bax。 RPMI 8226细胞经10 μmol/L姜黄素处理24小时后，survivin、Bcl?2 mRNA表达下调，而Bax表达上调。结论：姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖，并诱导凋亡。姜黄素的抗瘤机制可能与凋亡相关蛋白survivin、bcl?2、bax在转录水平的调节有关。
【关键词】 多发性骨髓瘤
Effect of Curcumin on Expression of Survivin, Bcl?2 and Bax in Human Multiple Myeloma Cell Line
Abstract To explore the mechanisms of suppression growth and induction apoptosis of curcumin on human multiple myeloma cell line RPMI8226， the suppressive effect of curcumin on RPMI8226 was examined by MTT assay； the induction apoptosis and cell cycle arrest of curcumin on RPMI8226 were determined by flow cytometry (FCM)； the changes of survivin,Bcl?2,Bax mRNA levels were detected by RT?PCR. The results showed that curcumin obviously suppressed the proliferation of RPMI8226 in both time? and dose?dependent manners， and the IC50 were 12.15 μmol/L, 4.9 μmol/L for 24 and 48 hours respectively. FCM indicated that the apoptosis ratio rose from 10.6% of untreated cells up to 36.9% of treated cells (p<0.05)， and curcumin arrested cell cycle of RPMI8226 at G2/M phase. RT?PCR showed that RPMI8226 cells expressed survivin,Bcl?2 strongly and Bax slightly; while RPMI8226 cells were treated with curcumin 10 μmol/L for 24 hours, the expressions of survivin,Bcl?2 mRNA were apparently down?regulated， and the expression of Bax mRNA was markedly up?regulated. It is concluded that curcumin can suppress the proliferation of human multiple myeloma cell line RPMI8226, and induce their apoptosis. The mechanism of antitumous effect of curcumin may be related to down?regulation of survivin,Bcl?2 mRNA and up?regulation of Bax mRNA.
Key words curcumin； multiple myeloma; RPMI8226 cell line； survivin； Bcl?2； Bax
J Exp Hematol 2007; 15(4):762-766
姜黄素（curcumin）是从姜黄属（Curcuma longa L.）植物根茎中提取的一种植物多酚，已被广泛用于食品色素、防腐剂及佐味剂。体内外大量研究表明，姜黄素具有多方面的药理作用，如抗肿瘤、抗炎、抗氧化等［1］。由于姜黄素具有毒副作用小、安全的特点，其抗肿瘤作用日益受到学者的关注，已成为研究的热点，但姜黄素对多发性骨髓瘤（MM）的影响，国内少见报道。
MM是一种起源于B淋巴细胞并分泌大量单克隆免疫球蛋白的恶性浆细胞病。传统化疗方案的改进，靶向药物的出现，以及自体造血干细胞移植，提高了MM患者的中位生存期。但是，患者的高龄，MM发病机制的复杂，以及多药耐药的出现，限制了化疗药物的疗效，目前MM仍被认为是不可治愈的疾病。为了寻找新型安全低毒的药物，我们研究姜黄素对MM细胞的作用。并通过探讨姜黄素对凋亡相关蛋白survivn、Bcl?2、Bax转录水平的变化来阐明其抗肿瘤效应机制。
材料和方法
试剂
姜黄素（分子式为C21H20O6，相对分子质量368.4 ，纯度≥95 %（Cayman公司产品），用DMSO稀释成0.1 mmol/L，等量分装，-20℃保存； MTT（Sigma公司产品）；RPMI 1640培养液 (Gibco公司产品 ) ；新生牛血清（杭州四季青公司产品）；反转录试剂盒(Promega公司产品)；TRIZOL 试剂(Invitrogen公司产品)；PCR引物由上海生工生物工程公司合成。
多发性骨髓瘤细胞RPMI8226由本科实验室冻存，用含10% 的新生牛血清的RPMI 1640培养液在37℃及5%的CO2条件下培养。取对数生长期细胞进行实验，实验分对照组和姜黄素处理组。
MTT实验
取对数生长期细胞，制备细胞悬液，每孔接种100 μl（约1×104细胞）。实验组分7个组，姜黄素浓度分别为0、2.5、5、7.5、10、15、20、40 μmol/L，每组3个复孔，另设空白调零孔。每孔加入不同浓度的姜黄素50 μl，37℃、5% CO2孵箱中孵育24、48小时。实验终止前4小时，每孔加入MTT（5 mg/ml）10 μl。孵育4小时后加入酸化SDS（10% SDS+0.01 mol/L HCl）100 μl，孵育过夜，充分溶解甲瓒结晶物。次日晨，紫外分光光度仪570 nm处测各孔OD值。测抑制率，其公式为：
抑制率%=（1-实验组/对照组）×100%
实验重复3次，取各浓度下平均抑制率，运用IC50软件计算IC50值。
流式细胞术检测
取对数生长期细胞，分实验组和对照组，每组约3×106细胞，实验组姜黄素浓度为10 μmol/L，处理24小时。Anexin V+PI染色测细胞凋亡，每次检测约5 000个细胞，共检测3次，取均值。取对数生长期细胞，分12、24小时处理组和对照组，每组约3×106细胞。处理组姜黄素浓度为10 μmol/L。第12、24小时收集细胞，用预冷PBS洗2次，固定。PI染色测细胞周期，每次检测约5 000个细胞，共检测3次，取均值。
RT?PCR检测
总RNA提取 取对数生长期细胞，10 μmol/L姜黄素处理24小时后，离心收集细胞，另取正常细胞作为对照。按Invitrogen公司试剂盒说明书规定的操作步骤提取总RNA。用紫外分光光度计测定RNA纯度，同时进行RNA定量。
逆转录反应 参照逆转录试剂盒说明书的步骤进行。在0.5 ml Eppendorf管中加入总RNA 11 μl、多聚寡核苷酸1 μl，轻轻混匀，轻离心1000 rpm数秒钟使沉管底，70℃孵育5分钟，然后迅速置于冰上。上述混合物中加入5×buffer 4 μl，RNA酶抑制剂（20 U／μ1）1 μl， 10 mmol／L dNTP 2 μl，M?MULV逆转录酶（200 U／μ1）1 μl，总体积20 μl，42℃孵育60分钟，终止反应，cDNA产物-20℃保存或即用。
PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。Survivin正义链5′?TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT?3′，反义链5′?AGCCAGTCCCCCACAGCAT?3′，目的基因466 bp［2］。Bcl?2正义链5′?GTGGAGGAGCTCTTCA?GGGA?3′，反义链5′?AGGCACCCAGGGTGATGCAA?3′，目的基因304 bp［3］。Bax正义链5′?GCCCACCAGCTCTGAGC?AGATCAT?3′，反义链5′?CGGCAA?TCATCCTCTGCAGC?3′，目的基因209 bp［4］。GAPDH正义链5′?TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA?3′，反义链5′?TGGCATGGACTGTGGTCATGAGTC?3′，目的基因525 bp［5］。
50 μl总反应体系(survivin和GAPDH)： 10×buffer 5 μl（含25 mmol/L MgC12 3 μl），10 mmol/L dNTP 1 μl，Taq 酶(5U/ μl)0.5 μl，正、反义链引物(10 μmol/L)各2 μl， cDNA 2 μl，无菌双蒸水37.5 μl。Survivin的反应条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；GAPDH的反应条件为：94℃变性40秒、61℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环。
25 μl总反应体系(Bcl?2和Bax)： 10×buffer 2.5 μl（含25 mmol/L MgC12 1.5 μl），10 mmol/L dNTP 0.5 μl，Taq 酶(5U/ μ1)0.25 μl，正、反义链引物(25 μmol/L)各0.25 μl，cDNA 1.25 μl，无菌双蒸水20 μl。反应条件为94℃变性40秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
电泳及图像分析 PCR产物在1．5％琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪进行拍照记录。用BandScan4.0软件进行灰度扫描。用总灰度表示各条带mRNA表达量，比较各泳道目的条带与相应内参GAPDH的灰度比，作为各目的条带mRNA的相对含量。取3次独立电泳的灰度比，平均值。
统计分析
计量资料用均数±标准差表示。选用双因素方差分析和t检验。所有数据用统计学软件SPSS 13.0进行分析，p<0.05为具有统计学意义。
结 果
MTT检测
MTT检测结果显示，不同浓度的姜黄素均可以抑制RPMI8226细胞生长，且表现为时间和浓度依赖性（图1）。姜黄素处理24小时与48小时后，同一浓度下的抑制率之间有明显差别（p<0.05），这说明随着时间的延长，姜黄素的抑制增殖效应增加。在同一时间点，不同浓度下的抑制率之间也有明显差别（p<0.05），说明随着浓度的增加，姜黄素的增殖抑制效应逐渐增加。24小时IC50为12.15 μmol/L，48小时IC50为4.9μmol/L。
Figure 1. Inhibitory effect of curcumin on RPMI8226 cells.
流式细胞术检测
10 μmol/L姜黄素处理24小时后，早期凋亡细胞百分比由原来的10.6%上升到36.9%，统计学差异显著(p<0.05)（图2）。
Figure 2. Apoptosis induced by curcumin in RPMI8226 cells.
10 μmol/L姜黄素处理24小时后，RPMI8226 G1期细胞逐渐减少，G2/M期细胞逐渐增多，表现为G2/M期阻滞（图3）。
Figure 3. Effect of curcumin on cell cycle of RPMI8226 cells. Group control： G0/G1 36.0%， S 46.1%， G2/M 17.9%； Group 12 hours： G0/G1 23.0%， S 51.8%， G2/M 25.2%； Group 24 hours：G0/G1 18.8%， S 35.7%， G2/M 45.5%.
RT?PCR检测
检测结果表明，RPMI8226细胞强表达survivin和Bcl?2, 弱表达Bax。RPMI8226细胞经20 μmol/L姜黄素处理24小时后，survivin和Bcl?2的表达与对照组相比明显减少（0.946±0.030 vs 0.633±0.048， p<0.01）(0.652±0.035 vs 0.215±0.014， p<0.01)，而Bax表达增强（0.131±0.043 vs 0.394±0.096， p<0.05）（图4）。这些结果显示，姜黄素能在转录水平下调survivin、Bcl?2的表达，上调Bax的表达。
讨 论
姜黄素为植物多酚类化合物，多项研究已经显示，其对不同组织来源的恶性肿瘤细胞(胃癌［6］，结肠癌［7］，前列腺癌［8］，肾癌［9］，淋巴瘤［10］，白血病［11］等细胞系) 都显示了良好的抗肿瘤活性。大量实验研究表明，姜黄素可以抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移，其机制十分复杂。姜黄素抑制NF?kB活性［8］，抑制许多激酶和酶的活性，诸如蛋白激酶C、磷酸化酶激酶、表皮生长因子受体、erbB2、鸟苷酸脱羧酶，乙酰转移酶等［12、13］，还影响凋亡相关蛋白Bax,、Bcl?2和P53的表达［14］。
Survivin 是近来发现的人类凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis family, IAPs)的 成员之一, 具有抑制细胞凋亡和调节细胞周期和细胞分裂的双重功能。Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抑制细胞凋亡的作用远大于Bcl?2家族成员［15］。研究表明, 多数肿瘤细胞都表达survivin, 而在大部分终末分化正常组织细胞中无表达。在临床研究中，急性白血病耐药组患者survivin表达显著高于对化疗敏感组，提示survivin高表达与肿瘤的多药耐药有关［16］。李娟等检测正常人及初治和复发/难治的多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓细胞中survivin mRNA表达的阳性率分别为22.2％、70.5％和83.3％，而且骨髓瘤患者表达率和表达水平显著高于正常人，难治／复发MM组表达水平高于初治组，提示survivin可作为逆转MM细胞多药耐药的潜在靶点［17］。关于survivin的调控机制目前尚不清楚。报道，姜黄素可以通过P53［14］、STAT3［18］来调节肿瘤细胞凋亡，而野生型P53和STAT3信号通路可能参与了survivin的转录调控［19］。本实验表明，姜黄素可能对Survivin的转录表达产生影响。
Bcl?2和Bax是Bcl?2家族成员中的1对凋亡调控基因，定位于线粒体外膜的Bcl?2可能是线粒体PT孔道的组成成份，能调节线粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性。线粒体外膜上的Bax能允许一些离子和小分子物质（细胞色素C等）穿过线粒体膜，进入细胞质，从而引起细胞凋亡，而Bcl?2的作用正好相反，它能封闭Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，从而保护细胞免于凋亡；Bcl?2还能将凋亡蛋白前体Apaf?1等定位至线粒体膜上，使其不能发挥凋亡作用。许多生长因子和细胞因子都能诱导Bcl?2的表达。影响抗凋亡蛋白Bcl?2和促凋亡蛋白Bax的相对表达量，从而改变肿瘤细胞的凋亡敏感性。
本研究显示，RPMI8226细胞均强表达survivin和Bcl?2 mRNA，而弱表达Bax。RPMI8226细胞经微摩尔级姜黄素处理后，能显著下调survivin，Bcl?2 mRNA的表达，同时Bax表达明显上调，促进了骨髓瘤细胞凋亡。P53蛋白可以上调促凋亡因子Bax的表达，下调抗凋亡因子Bc1?2的表达而实现其促凋亡作用［20］。P53蛋白也可直接或间接地结合于survivin基因启动子，抑制其转录表达［21］。可见，P53 与survivin、Bcl?2、Bax具有相关性；在多发性骨髓瘤细胞系中，姜黄素是否通过P53来影响三者的转录表达，其具体机制如何，尚需进一步研究证实。姜黄素作为一种新型的抗肿瘤制剂，在MM的临床应用中具有一定的前景。
【文献】
1Sharma RA, Gescher AJ, Steward WP. Curcumin： the story so far. Eur J Cancer, 2005; 41：1955-1968
2王艳，陈静，林凤茹等. survivin与smac基因在急性白血病中的表达及临床意义. 中华血液学杂志, 2005；26：753-755
3刘筱梅，徐酉华，于洁等. 儿童急性白血病survivin,bcl?2,mdr1的表达及意义. 重庆医科大学学报,2006；31：215-218
4胡靖姿, 刘惠敏 ,李玉莉等. Bcl?2、Bcl?Xl和Bax在结直肠癌中的表达. 第二军医大学学报, 2006；27：249-252
5高广勋，陈协群，张永清等. Rac1在HL?60细胞中的表达及其对细胞周期和凋亡的影响. 实验血液学杂志, 2006；14：11-14
6Tang XQ, Bi H, Feng JQ， et al. Effect of curcumin on multidrug resistance in resistant human gastric carcinoma cell line SGC7901/VCR. Acta Pharmacol Sin, 2005；26：1009-1016
7Kim KH，Park HY，Nam JH， et al. The inhibitory effect of curcumin on the growth of human colon cancer cells (HT?29, WiDr) in vitro. Korean J Gastroenterol, 2005；45：277-284
8Deeb D, Jiang H, Gao X, et al. Curcumin sensitizes prostate cancer cells to tumor necrosis factor?related apoptosis?inducing ligand/Apo2L by inhibiting nuclear factor? kappaB through suppression of IkappaBalpha phosphorylation. Mol Cancer Ther, 2004； 3：803-812
9Woo JH, Kim YH, Choi YJ, et al. Molecular mechanisms of curcumin?induced cytotoxicity: induction of apoptosis through generation of reactive oxygen species, down?regulation of Bcl?XL and IAP, the release of cytochrome C and inhibition of Akt. Carcinogenesis, 2003；24：1199-1208
10Chen WH，Chen Y，Cui GH. Effects of TNF?alpha and curcumin on the expression of VEGF in Raji and U937 cells and on angiogenesis in ECV304 cells. Chin Med J (Engl), 2005；118：2052-2057
11Han SS, Keum, YS, Seo HJ，et al. Curcumin suppresses activation of NF?kappaB and AP?1 induced by phorbol ester in cultured human promyelocytic leukemia cells. J Biochem Mol Biol, 2002； 35：337-342
12Manson MM. Inhibition of survival signalling by dietary polyphenols and indole?3?carbinol. Eur J Cancer,2005；41: 1842-1853
13Balasubramanyam K, Varier RA, Altaf M， et al. Curcumin, a novel p300/CREB?binding protein?specific inhibitor of acetyltransferase, represses the acetylation of histone/nonhistone proteins and histone acetyltransferase?dependent chromatin transcription. J Biol Chem, 2004； 279: 51163-51171
14Song G, Mao YB, Cai QF, et al. Curcumin induces human HT?29 colon adenocarcinoma cell apoptosis by activating p53 and regulating apoptosis?related protein expression. Braz J Med Biol Res, 2005; 38: 1791-1798
15都昌胡，徐军. 凋亡蛋白抑制剂家族研究进展. 世界华人消化杂志，2005；13：1581-1589
16李中东，齐振华，曹星玉等. 急性白血病患者Survivin基因表达与耐药的关系. 临床内科杂志，2004； 21：157-159
17李娟，赵莹，张殿宝等. Survivin在多发性骨髓瘤患者骨髓细胞中的表达及其临床意义. 癌症，2005； 24：1522-1526
18Bharti AC, Donato N, Aggarwal BB. Curcumin (diferuloylmethane) inhibits constitutive and IL?6?inducible STAT3 phosphorylation in human multiple myeloma cells. J Immuno, 2003; 171:3863-3871
19Johnson ME, Howerth EW. Survivin： a bifunctional inhibitor of apoptosis protein, Vet Pathol, 2004：599-607
20马琳琳，孙文靖，傅松滨. p53基因王国. 国外医学·遗传学分册. 2005; 28：15-20
21Sah NK, Khan Z, Khan GJ, et al. Structural, functional and therapeutic biology of survivin. Cancer Lett, 2006; 244:164-171
