硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL?60细胞凋亡实验研究
作者：孙启鑫，孟凡义，扶云碧，李利
【摘要】 本研究探讨硼替佐米（bortezomib， Bor）单用或联合三尖杉酯碱（harringtonine， HT）对HL?60细胞凋亡的影响。以不同浓度Bor、HT处理HL?60细胞12-48小时，采用MTT比色法检测细胞增殖活性，以DNA凝胶电泳、荧光显微镜检、流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明： 10-50 nmol/L Bor可有效抑制HL?60细胞增殖，并诱导其凋亡。其中10 nmol/L剂量处理12小时即有细胞凋亡发生，延长作用时间或增加药物剂量可使细胞凋亡率明显增加。30 nmol/L HT与10 nmol/L Bor联合应用时，可见HL?60细胞凋亡率比两种药物单独使用时显著增加。结论： Bor对HL?60细胞具有时间和剂量依赖性的细胞凋亡诱导效应，与HT联合应用有明显的协同作用。
【关键词】 硼替佐米； 三尖杉酯碱； 凋亡
Induction of Apoptosis in HL?60 Cells by Bortezomib alone or in Combination with Harringtonine In Vitro
Abstract The aim of this study was to investigate the effect of bortezomib alone and in combination with harringtonine on apoptosis of HL?60 cells. HL?60 cells were treated with bortezomib, harringtonine in different concentrations for 12-48 hours. Cell proliferation was analyzed by MTT assay； the apoptosis of HL?60 cells was observed by DNA gel electrophoresis， fluorescence microscopy and flow cytometry. The results showed that 10-50 nmol/L bortezomib could effectively inhibit HL?60 cell proliferation, and induced its apoptosis. After treating for 12 hours, 10 nmol/L bortezomib could trigger cells apoptosis. With time prolongation or dose increase, HL?60 cell apoptotic rate significantly increased. Furthermore, co?administration of bortezomib (10 nmol/L) with harringtonine (30 nmol/L) resulted in a higher cell apoptotic rate when compared with that induced by those agents used alone. It is concluded that the bortezomib can induce HL?60 cells apoptosis in a time?and?dose?dependent manner and synergistic effectiveness can be found when bortezomib combined with harringtonine.
Key words bortezomib; harringtonine; apoptosis
J Exp Hematol 2007; 15(2):233-236
急性白血病是一类恶性克隆性疾病，虽然其水平近年来已有了明显提高，但仍有相当一部分患者因疾病复发或耐药而转变成难治的白血病，因此积极寻求新的治疗方法在当前仍然显得尤为重要。硼替佐米（bortezomib，Bor）是一种新型抗肿瘤靶向治疗药物，目前主要用于复发或难治的多发性骨髓瘤的治疗，并已显示出良好的疗效［1］。研究显示Bor在体外对多种恶性肿瘤细胞均具有良好的疗效，但在急性白血病方面的研究至今报道很少，更未见与三尖杉酯碱（harringtonine, HT)联合应用的研究报告。本研究首次揭示Bor与HT联合作用于HL?60细胞的效果，为临床用于治疗白血病提供理论依据。
材料和方法
试剂
RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品，MTT、Hoechst33342、碘化丙锭（PI）、RNA酶A、蛋白酶K均为Sigma公司产品。硼替佐米（bortezomib、Velcade、万珂）为美国Millennium公司产品（西安杨森制药有限公司惠赠），用无菌水配成1 mg/ml浓度备用。三尖杉酯碱注射液为北京协和制药厂产品，使用时稀释到实验所需的浓度。
细胞培养
HL?60白血病细胞株购自天津血液病研究所，用含10%小牛血清RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO2条件下培养，1-2天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)硼替佐米或联合三尖杉酯碱诱导HL?60细胞凋亡实验研究研究方案
依预试验结果，选择Bor（10-50 nmol/L）和HT（7.5-75 nmol/L）分别单独处理HL?60细胞12-48小时，观察药物剂量反应效应。根据药物反应结果，选择HT IC50剂量与Bor各浓度联合，观察药物联合后对HL?60细胞的协同效应。
细胞增殖活性MTT检测
对数生长期细胞调整密度为1×105 cells/ml，每孔100 μl接种，按要求加入不同浓度处理药物，终体积200 μl/well，每个浓度设3个复孔。培养至相应的时间后加入20 μl MTT（5 mg/ml），继续孵育4小时。离心并吸弃上清，加DMSO 170 μl/well,轻震荡，酶标仪测570 nm OD值（A）。细胞活力:
细胞活力（%）=（A处理组－A调零组/A对照组－A调零组）×100%
细胞形态学观察
Hoechst33342以终浓度10 μg/ml加入培养板各处理组细胞中，避光染色15分钟，倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。
DNA提取及电泳
参照［2］,分别收集各浓度药物处理的细胞5×105个，用PBS洗涤1次，加入20 μl裂解缓冲液［EDTA 20 mmol/L, Tris 100 mmol/L, pH 8.0, 0.8%(w/v) SDS］和10 μl RNA酶A（10 mg/ml）, 37℃水浴60分钟。再加入10 μl蛋白酶K（20 mg/ml）,55℃水浴120分钟。取20 μl样品加6 μl 10×DNA上样缓冲液，80 V，电泳50分钟。紫外灯下显示，拍照。
流式细胞术分析
分别收集各浓度药物处理的细胞1×106个，用PBS洗涤后，70%乙醇4℃固定。24小时后用PBS再洗涤1次，加1 ml PI(100 μg/ml)和RNA酶A（100 μg/ml）染液，于4℃避光染色30分钟，400目筛网过滤后，流式细胞仪检测。
统计学分析
所有实验至少重复3次，应用SPSS 10.0软件进行数据分析，均数比较采用t检验，设定P＜0.05为显著性差异。
结 果
HL?60细胞增殖活性
10-50 nmol/L Bor 对HL?60细胞的增殖均有一定抑制作用，表现为时间?剂量依赖关系，随浓度增加和时间延长抑制效果逐渐增强（图1），其24小时的IC50为20 nmol/L。30 nmol/L剂量处理12-48小时，细胞抑制率与对照组相比差别均有显著性意义（P<0.01）；作用24小时时，抑制效果达到最大，但与48小时相比差别无统计学意义（P=0.328），而与12小时或18小时相比，抑制效果明显增强，有显著性意义（P=0.002、P=0.011），其余浓度也均可见类似。以7.5、15、22.5、30、37.5、56.2、75 nmol/L HT处理HL?60细胞24小时，细胞活力分别下降为对照的92%、82%、61%、47%、33%、23%、21%，也显示出明显的剂量依赖性抑制效应，其24小时的IC50剂量约为30 nmol/L。选择30 nmol/L HT与Bor各浓度联合，可见在达到最大抑制效果前，联合处理组对细胞的抑制作用比同剂量两药任一种单独使用时都显著增强(P＜0.01）（图2）。
细胞形态学改变
Hoechst33342染色显示，经24小时培养后对照组细胞无凋亡发生，细胞核呈均匀、弥散的蓝色荧光（图3A）；而Bor（图3B）与HT（图3C）单独或联合处理组均可见细胞凋亡现象，表现为细胞核凝集、固缩，形成质密明亮的蓝色荧光颗粒；且单位视野下10 nmol/L Bor与30 nmol/L HT联合处理组凋亡细胞数量明显多于同剂量Bor或HT单独处理组（图3D）。
DNA凝胶电泳
10-50 nmol/L Bor 处理细胞12小时，DNA凝胶电泳均可见明显DNA Ladder出现, 其中10 nmol/L Bor处理组还可见正常基因组DNA条带和凋亡DNA Ladder共存。相同条件下，延长作用时间至24小时，各处理组仍可见明显DNA Ladder，但10 nmol/L处理组正常基因组条带消失，显示随时间延长Bor作用效果增强。此外，30 nmol/L HT单独或与10 nmol/L Bor联合处理细胞24小时，DNA凝胶电泳也均显示出明显DNA Ladder。
流式细胞术检测
对照组经12小时和24小时培养细胞无明显凋亡，亚G1期、G0/G1期、G2/M期细胞比率分别为2%、53%和24%，而 Bor与HT各处理组则均可见凋亡亚G1峰出现，其中Bor各处理组细胞凋亡率还呈现随剂量增加而明显增高的规律。10 nmol/L Bor处理细胞12小时和24小时，凋亡率分别为5%和19%。30 nmol/L Bor处理12小时和24小时，凋亡率分别为59%和62%，显著高于同时间10 nmol/L处理的效果（P值均<0.01）。HT 30 nmol/L处理细胞24小时，细胞凋亡率、G0/G1期比率明显增加，分别为11%和65%，与10 nmol/L Bor联合应用后，细胞凋亡率进一步增至44%，显著高于各药物单独处理时效果P<0.01（图4）。
讨 论
Bor是一种新型抗肿瘤靶向药物，主要通过抑制真核细胞26S蛋白酶体对蛋白质的降解，促使多种与细胞增殖、分化、存活、凋亡密切相关的蛋白代谢发生紊乱，诱导细胞凋亡［3］。研究表明，Bor能有效抑制放疗、化疗引起的NF?кB激活，阻止多种抗凋亡蛋白和细胞因子的转录，增加细胞对放疗、化疗的敏感性；同时，通过稳定多种细胞周期蛋白（P53，P21，P27）的表达，促使细胞发生周期阻滞，诱导细胞凋亡［4］。
目前，作为第一个被FDA批准应用于临床的蛋白酶体抑制剂类药物——Bor对复发或难治的多发性骨髓瘤患者已显示出良好的疗效，对白血病的疗效也正在评价之中。Gatto等［5］报道，多种髓系白血病细胞株对Bor均敏感，单独应用时其IC50剂量均在10-15 nmol/L之间。Horton等［6］发现，Bor不但对各型急性白血病细胞株有效，对白血病原代细胞也具有明显抑制作用，但不同细胞类型对其敏感性略有差异。急性淋巴细胞白血病细胞株（Jurkat、Molt4等）敏感性最高（平均IC50为7.5 nmol/L），急性髓系白血病原代细胞敏感性最差（平均IC50为30 nmol/L）。本研究显示，对于急性髓系白血病HL?60细胞，Bor 的有效抑制浓度为10-50 nmol/L，其中10 nmol/L剂量处理12小时即可抑制HL?60细胞增殖，30 nmol/L处理24小时达最大抑制效果，这与国外报告基本一致［6］。
Dai等［7、8］报道，Bor与细胞周期激酶抑制剂flavopiridol联合应用，对U937细胞和Bcr/Abl+的K562细胞具有明显的协同诱导凋亡效应。Horton等［4］报道，Bor体外联合地塞米松、热休克蛋白抑制剂格尔德霉素（geldanamycin），可明显增强它们对各自敏感细胞株的细胞毒作用；Bor分别与长春新碱、阿霉素、阿糖胞苷、门冬酰胺酶，Bcl?2抑制剂（HA 14.1）联合应用时，细胞毒作用也均比各自单用时明显增强。另外，Smolewski 等［9］报道，对于B?CLL原代细胞，小剂量5 nmol/L Bor单用时细胞抑制率即为48%，联合CD52单克隆抗体应用后抑制率显著增至64%，如果将用药顺序改为预先应用CD52单克隆抗体作用24小时，再加入Bor，结果细胞抑制率比它们同时应用时还要高。本研究中，我们首次将HT与Bor进行联合应用，研究它们对HL?60细胞增殖、凋亡的影响，结果发现10 nmol/L Bor 与30 nmol/L HT单用24小时，细胞凋亡率分别为19%和11%，而联合后凋亡率显著增至44%，显示两者之间具有明显的协同作用。但在临床急性白血病治疗中，如HA 方案联合Bor同时应用，对患者是否会产生更好的疗效，值得进一步探讨。目前，Bor单独或联合各种化疗治疗白血病的临床试验已经展开，已有Ⅰ期临床试验报道［10］，对于难治或复发的急性白血病患者，Bor单药最大耐受剂量为1.25 mg/m2，常见的剂量相关性副反应有恶心、呕吐、 直立性低血压、血小板减少等，最终在参加试验的15人中，5人获得了明显的血液学改善。此外，另一项评价Bor与阿糖胞苷（100 mg/m2，1-7天）、去甲氧柔红霉素（12 mg/m2，1-3天）方案联用安全性的Ⅰ期临床试验也正在进行之中［11］，初步结果显示: 1.0 mg/m2 剂量Bor与阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素联合应用，患者的耐受性均良好。在目前可评价的12名急性髓系白血病患者（均为18岁以上复发或60岁以上初发）中，有7例获得完全缓解。
总之，本研究显示Bor能够有效地诱导白血病HL?60细胞凋亡，与HT联合应用，凋亡效果显著增强，显示了很好的临床应用前景。
【文献】
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