巢式MSP检测砷剂诱导人多发性骨髓瘤U266细胞系p16基因去甲基化及转录
【摘要】 本研究探讨用高灵敏度的DNA甲基化检测方法及DNA克隆测序分析法检测三氧化二砷（As2O3）的去甲基化作用，并对其可能的去甲基化作用机制进行分析。采用巢式甲基特异性PCR法（nested?methylation specific PCR， n?MSP）、DNA克隆测序分析法检测As2O3作用前后U266细胞株p16基因甲基化状态，应用RT?PCR检测p16、DNA甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达，以生长曲线、MTT法、集落形成实验检测As2O3对骨髓瘤细胞生长和增殖的抑制作用。利用流式细胞仪DNA 含量分析法探讨As2O3 对多发性骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果表明： ①未处理组U266细胞基因组DNA 的胞嘧啶保持不变,而经As2O3作用的U266细胞基因组DNA 的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶，这说明U266细胞存在p16基因甲基化， As2O3作用后p16 基因异常甲基化的现象被逆转； ②未处理组细胞p16基因不表达，As2O3作用72小时后p16基因表达增强，0.5 μmol/L组、1.0 μmol/组和2.0 μmol/组p16基因表达阳性条带灰度值与β?肌动蛋白比值分别为(0.22±0.10)、(0.59±0.11)、(0.68±0.09)，阳性对照灰度比值为(0.77±0.13)，差异有非常显著的统计学意义（P<0.01）；③与未处理组相比，As2O3作用72小时后甲基转移酶（DNMT）1、DNMT3A、DNMT3B 的表达下降并呈浓度依赖性；④与对照组相比，3 组不同浓度As2O3均能明显抑制骨髓瘤细胞生长，G0-G1期细胞增加。结论： As2O3可能通过抑制甲基转移酶（DNMT1）、DNMT3A、DNMT3B和（或）直接对p16 基因去甲基化，使p16 基因表达上调，恢复其活性，从而实现其对细胞周期的调控功能，将细胞阻滞于G0-G1期，抑制骨髓瘤细胞的增长。
【关键词】 巢式MSP p16基因去甲基化 三氧化二砷 多发性骨髓瘤 U266细胞 甲基转移酶
n?MSP Detection of p16 Gene Demethylation and Transcription in Human Multiple Myeloma U266 Cell Line Induced by Arsenic Trioxide
Abstract The study was purposed to investigate the effect of arsenic trioxide(As2O3)? induced p16 gene demethylation by a sensitive and specific PCR?based method (nested?methylation specific PCR, n?MSP) and DNA sequencing for rapid analysis of the promoter demethylation status, and to explore the possible mechanism of the p16 gene demethylation in human multiple myeloma U266 cells induced by As2O3. The methylation status of the p16 gene in U266 cell line before and after treatment with As2O3 was detected by the nested?methylation specific PCR and DNA sequencing, the mRNA of p16, DNA methyltransferase (DNMT 1、DNMT3A and 3B) gene were determined by RT?PCR, and the induced growth inhibition of U266 cell was assayed by growth curve, MTT and CFU; the DNA content of U266 cells was analyzed by flow cytometry after being exposed to As2O3. The results showed that (1) all cytosines in CpG dinucleotides in untreated U266 cell not were changed , while all cytosines in treated U266 cells with As2O3 had been converted to thymidine. (2) p16 gene was not expressed in U266 cell line after methylation. As compared with the β?actin, the expression of U266 cell p16 gene mRNA was increased to ( 0.22±0.10)、(0.59±0.11)、(0.68±0.09) after exposed to 0.5 μmol/L、1.0 μmol/L and 2.0 μmol/L As2O3 for 72 hours respectively . (3) As2O3 could significantly down?regulate DNA methyltransferase 1(DNMT 1)、 DNMT3A and DNMT3B gene at mRNA level in a dose?dependent manner. (4) U266 cells line grew slowly and arrested at G0-G1 phase after treatment with three different concentrations of As2O3. It is concluded that As2O3 can activate and up?regulate the expression of p16 gene which inhibits the proliferation of U266 cell through inducing the G0-G1 arrest by demethylation or/and by inhibiting DNMT 1、DNMT3A and 3B gene.
近年来的研究显示，DNA 的异常甲基化是一种与肿瘤发生密切相关的表遗传学机制, 其启动子区Cp G 岛的异常甲基化已成为抑癌基因表达失活的一条重要途径。据报道，人骨髓瘤U266细胞系由于CpG岛的甲基化,而导致该细胞系p16 基因表达失活［1］。我们以人骨髓瘤（MM）细胞株U266为对象，用巢式甲基特异性PCR法（nested?methylation specific PCR）、T?A 克隆及DNA序列分析、RT?PCR等方法研究三氧化二砷（As2O3）对人骨髓瘤U266细胞株p16基因的去甲基化作用及可能的机制，以及对细胞生长与细胞周期的影响。
材料
选用1 g/L As2O3注射液（哈尔滨伊达药业产品），用生理盐水配成1 mmol/L储存液，用前将RPMI 1640培养液稀释至所需浓度。RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，蛋白酶K为Amerco公司产品，RT?PCR及p16?F、p16?M、p16?U 引物由上海生工生物工程公司合成，流式细胞仪（FCM）为FACScan Becton Dickinson公司产品，DNA扩增仪2400为 PE 公司产品。
方法
细胞培养 U266细胞为福建血液病研究所传代保存，用含10%胎牛血清（杭州四季青公司产品）的RPMI 1640 培养液（Gibco公司），于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，48小时传代1次，培养中的细胞均保持在（0.1-0.5）×106/ml的密度，实验用细胞为对数生长期细胞。
细胞周期百分率的FCM检测 细胞以1×105/ml的起始浓度与不同浓度的As2O3孵育72小时后，收集各组细胞，用1/15 mol/L PBS洗涤2次，加入到Kenesis 50试剂盒(Bio?Rad公司产品)中，置18-25℃暗盒孵育30分钟后，于FCM上作细胞周期分析。
细胞生长曲线的绘制 U266细胞在37℃，5% CO2条件下，以1×105/ml启始浓度接种于含或不含上述药物的培养液中，培养过程中不换液，每天以台盼蓝拒染法作活细胞计数。
细胞增殖的MTT法检测 细胞以1×105/ml的起始浓度接种于96孔培养板，与不同浓度的As2O3孵育72小时后，每孔加入5 g/L MTT(Sigma公司产品)10 μl,继续培养4小时后倒置显微镜下拍照，离心后小心吸去上清，每孔加入DMSO 150 μl，充分震荡混匀，在酶标仪上用双波长492 nm和630 nm测A值，抑制率。
抑制率=［（未处理组A值?处理组A值）/
未处理组A值］×100%
以As2O3浓度为横轴，抑制率为纵轴绘制曲线，由此求出细胞生长抑制50%时的As2O3浓度(IC50)。
细胞形成集落能力的集落形成实验检测 将细胞以1×105/ml的起始浓度接种于6孔培养板，与不同浓度的As2O3孵育72小时后，用RPMI 1640培养液清洗2遍，以去除剩余药物，取活细胞按200个细胞/孔接种于24孔培养板，每组设3个平行孔。培养体系为1 ml含10%胎牛血清、0.8%甲基纤维素的RPMI 1640培养液，培养10-14天，于倒置显微镜下计数，以大于40个细胞为一个集落。
集落形成率=（集落数/接种细胞数）×100%
p16基因甲基化状态的巢式甲基特异性PCR (n?MSP)、T?A 克隆及序列分析检测 应用饱和酚?氯仿［2］抽提各组U266细胞基因组DNA ,经DNA Calculator(Pharmacia Biotech公司产品) 定量后,取2 μg DNA 定溶于50 μl去离子水中,经新鲜配制30 μl 10 mmol/L 氢醌及520 μl 3 mol/L 亚硫酸氢钠(均为美国Sigma 公司产品) 于50 ℃水浴脱氨基18小时 ,Wizard DNA Clean?up (美国Promega公司产品) 过柱纯化,无水乙醇沉淀并重新溶解于30 μl去离子水。以此为模板，用于巢式MSP法扩增p16引物序列［4］（表1）。第一轮PCR使用外侧引物，反应条件为95℃热启动10分钟，然后于95℃ 60℃、72℃各30秒循环40次，最后于72℃延伸10分钟。将第一轮PCR产物适当稀释（30-50倍），取2 μl，进行第二轮PCR扩增，p16甲基化引物即p16?M的退火温度升至65℃，p16非甲基化引物即p16?U的退火温度仍为60℃，反应时间减少为25秒，其他反应条件同第一轮，同时以正常人外周血淋巴细胞DNA为阴性对照，以等体积超纯水为空白对照。对于p16基因甲基化阳性的标本，经2次扩增后可扩出特异性p16?M条带，而p16?U基因扩增结果为阴性；反之，对于
p16基因甲基化阴性的标本，经2次扩增后可扩出特异性p16?U条带，而p16?M基因扩增结果为阴性.故而可根据标本的p16?M和p16?U同时扩增的情况判断该标本的甲基化状态。割胶回收各n?MSP 产物,选用PMD?18?T载体(TaKaRa公司产品)作连接,进一步转化感受态细菌，筛选阳性菌落，扩增培养，提取质粒DNA, 送上海博亚生物工程有限公司测序。
p16基因、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达水平的半定量RT?PCR检测 用TRIZOL试剂盒提取细胞RNA后测吸光度A值及电泳鉴定其质量。用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行转录，再以反应所得cDNA进行PCR扩增，引物序列见表1。将PCR产物与上样缓冲液以6∶1混合后，于16 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶图像分析仪上自动分析成像。以目的基因与actin的灰度比进行半定量分析。
统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件，采用单因素方差分析；实验组与对照组均数的两两比较采用Dunnett检验。
结 果
As2O3对U266细胞p16基因甲基化模式的影响
U266细胞甲基化模式改变情况 第一轮外侧引物扩增后，所有标本均可扩出清晰的1个280 bp的p16基因启动子区片段（图1），未处理组细胞在经过2次PCR扩增后可扩出特异性p16?M条带，而p16?U基因扩增结果为阴性，提示U266细胞p16基因高甲基化。0.5 μmol/L As2O3作用72小时组细胞(histiocyte)在经过2次PCR 均可扩出p16?M条带和p16?U，提示该组U266细胞p16基因部分甲基化。1.0 μmol/L及2.0 μmol/L As2O3作用72小时组细胞在经过2次PCR扩增后可扩出特异性p16?U条带，而p16?M基因扩增结果为阴性，提示这两组U266细胞p16基因高甲基化已被逆转（图2）。
p16基因甲基化状态的T?A克隆及序列分析 从图3中可见，未经过As2O3处理的U266细胞p16基因PCR扩增产物p16M DNA单链的鸟嘌呤保持不变，
说明其互补DNA单链中的胞嘧啶保持不变，提示胞嘧啶处于高度甲基化状态即5?甲基胞嘧啶，故经过硫化处理后不能使它转化为胸腺嘧啶；而经过As2O3处理的U266细胞p16基因扩增产物p16U DNA单链的鸟嘌呤已转变为腺嘌呤，说明其互补DNA单链中的胞嘧啶已转化为胸腺嘧啶，提示胞嘧啶甲基化状态已被As2O3所逆转，硫化处理使其转化为胸腺嘧啶。
As2O3对U266细胞生长、增殖及活力的影响
As2O3对U266细胞生长有明显的抑制作用，不同浓度组与对照组比较差异有显著意义（P<0.05），U266倍增时间明显延长（P<0.05）（图4）。MTT法检测表明，用药72小时后，与未处理组相比不同浓度As2O3 (0.5、1.0、2.0) μmol/L组的细胞抑制率分别为（19.4±0.44）%、（35.0±0.19）%、（65.2±0.13）%， IC50约为（1.49±0.22）μmol/L。集落形成抑制实验表明: As2O3抑制U266集落形成，并呈剂量依赖性（P<0.05）。空白组、0.5 μmol/L组、1.0 μmol/L组和2.0 μmol/L组的细胞集落形成率依次为 (68.5±1.3)%、（46.5±0.8）%、（30.0±1.8）%、（27.5±1.2）% (图5)。
As2O3对细胞周期的影响
在不同浓度的As2O3 作用下，G0-G1期细胞增加，与对照组相比较，统计学差异均有显著性（P<0.05），结果见表2。
As2O3对U266细胞P16、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA表达的影响
As2O3 处理U266细胞72小时之后，测定p16基因mRNA的表达，结果未用药组未见表达，不同浓度As2O3 (0.5、1.0、2.0 μmol/L)处理的U266细胞 p16 表达增强，正常淋巴细胞为阳性对照（图6）。经图像分析仪显示，经As2O3处理各组的条带灰度值与β?actin 比值分别为(0.22±0.10)、(0.59±0.11)、(0.68±0.09)，而阳性对照灰度比值为(0.77±0.13)，故低于阳性对照组（P<0.01）。
Figure 6. P16 mRNA expression after treatment of U266 cells with different concentrations of As2O3 for 72 hours. M: DNA marker. Lane 1: control group of normal lymphocyte. Lane 2： 2.0 μmol/L As2O3 group. Lane 3： 1.0 μmol/L As2O3 group. Lane 4： 0.5 μmol/L As2O3 group. Lane 5： drug?untreated group.
U266细胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达与正常对照相比较有明显增高，As2O3对U266细胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B表达在mRNA水平有下调作用且有剂量依赖性：未用药组、不同浓度As2O3 (0.5、1.0、2.0) μmol/L组其DNMT1 阳性条带灰度值与β?actin 比值分别为(1.22±0.24)、(0.94±0.10)、(0.43±0.11)、(0.16±0.05)；正常对照组为(0.14±0.03)，未加药组U266细胞DNMT1的表达是正常对照的8.71倍。未用药组、不同浓度As2O3 (0.5、1.0、2.0) μmol/L组DNMT3A 阳性条带灰度值与β?actin 比值分别为(0.72±0.09)、(0.43±0.07)、(0.21±0.10)，(0.17±0.06)，正常对照组为(0.11±0.04)。未加药组U266细胞DNMT3A的表达是正常对照的6.45倍。未用药组、不同浓度As2O3 (0.5、1.0、2.0) μmol/L组DNMT3B阳性条带灰度值与β?actin 比值分别为(0.49±0.09)、(0.26±0.08)、(0.18±0.06) 、(0.11±0.04)；正常对照组为(0.10±0.05)。未加药组U266细胞DNMT3A的表达是正常对照的4.90倍 (P<0.01)（图7、8、9）。
讨 论
DNA 甲基化是一种发生在CG二核苷酸上对胞嘧啶的共价修饰,是由5?腺苷蛋氨酸(SAM) 提供甲基,在细胞内DNMT 催化作用下,于DNA 复制后形成5 甲基胞嘧啶的反应［2 ］ 。该反应是对基因的转录和拼接具有重要影响的一种新的调控机制。已有研究发现,DNA 甲基化主要特征为DNA 广泛低甲基化和部分区域的高甲基化共存,其中抑癌基因启动子区的高甲基化能抑制其转录,进一步使抑癌基因失活,从而推测DNA 甲基化参与肿瘤的发生和［3］。
p16基因是近年来发现的一个多重抑癌基因,位于染色体9P21 ,其编码的p16 蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶4 ( cycline?dependent kinase 4 , CDK4) 的抑制剂,在细胞周期的调控中起重要作用［4］。P16蛋白与cyclin D竞争结合CDK4，抑制CDK4活性，使PRb不能磷酸化而保持活化状态，抑制转录因子E2F解离，使细胞周期进展最关键的G1/S转换停滞，对细胞周期起负调控作用。近年来研究发现，p16 基因启动子CG岛异常高甲基化失活存在于多种恶性血液病的发生、发展中，并可能与恶性血液病疾病的效果和预后有关［5，6］。 我国傅卫军等［7］报道，骨髓瘤患者中p16基因发生异常甲基化的比例为55%,提示p16基因的异常甲基化与骨髓瘤的发生有密切关系。尚有研究认为，PRb对IL?6的产生有抑制作用，p16通过抑制PRb磷酸化而保持其活性，抑制IL?6产生，而IL?6是骨髓瘤细胞关键生长因子，提示P16基因可抑制骨髓瘤细胞［8］。
DNA异常甲基化的确切机制目前尚不明了。据Mizuno等［9］报道，在急慢性髓系白血病中催化DNA甲基化的3种甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）的表达均有不同程度的上调，提示DNA的异常甲基化可能与细胞内DNMT 活性增强有关。本实验研究发现，p16基因高度甲基化的U266细胞株中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B表达较正常对照组明显增高，可以认为DNMT1、DNMT3A、DNMT3B活性增高导致抑癌基因甲基化模式的改变可能是骨髓瘤发病机制之一。
砷剂进入人体后，三价砷在肝脏内被还原发生甲基化，S腺苷甲硫氨酸的甲基转移到砷分子上，形成一甲砷酸或二甲砷酸而被解毒。砷是一种原浆毒，因与巯基有很强的亲和力，与含巯基酶结合后，使酶活性受到抑制，严重干扰酶的生理功能、结构与代谢［10］。砷也干扰甲基转移酶。Mass 等［11］研究发现，砷剂对人类肺癌细胞系的p53基因的甲基化模式有作用，并提出了砷剂扰乱甲基化模式致癌的模型：①砷剂作为酶抑制剂，部分或选择性地抑制腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶，从而降低甲硫氨酸的利用率，使其浓度增高。未受抑制的甲基转移酶使胞嘧啶发生超甲基化，而肿瘤抑制基因超甲基化，会导致癌症。②砷剂消耗腺苷甲硫氨酸的甲基而被解毒，引起细胞内缺甲基状态，致使甲基化模式不稳定，导致去甲基化。
我们利用巢式甲基特异性PCR发现，人骨髓瘤U266细胞存在p16基因高度甲基化，经As2O3作用72小时后，该细胞p16基因甲基化程度明显降低或消失。经过T?A克隆测序MSP产物进一步证实，未经过As2O3处理的U266细胞p16基因PCR扩增产物DNA单链中的胞嘧啶经过硫化处理后保持不变，提示胞嘧啶处于高度甲基化；而经过As2O3处理的U266细胞p16基因扩增产物p16U DNA单链的胞嘧啶经硫化处理已转化为胸腺嘧啶，说明胞嘧啶甲基化状态已被As2O3所逆转。
我们研究发现，经As2O3作用逆转p16基因异常甲基化后，p16基因在mRNA水平上的表达得到恢复。临床上以10 mg/d As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病血药浓度峰值约是5 μmol /L。而体外研究发现，0.5 μmol/L As2O3作用U266细胞72小时后,即可诱导p16基因表达，2.0 μmol/L As2O3作用U266细胞72小时后, p16基因表达呈强阳性。这说明目前采用的As2O3治疗剂量能使p16基因去甲基化，并在mRNA 水平上调p16基因的表达。我们同时发现，As2O3能在mRNA 水平下调DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达并呈剂量依赖性。佟红艳等［12］报道，As2O3能够诱导人骨髓增生异常综合征MUTZ?1细胞株甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B mRNA水平的表达下调并呈剂量依赖性，我们的实验结果与他们相近。为此，我们推测As2O3对U266 细胞p16基因去甲基化可能机制是： ①砷剂通过竞争甲基引起细胞内缺甲基状态，导致p16 基因去甲基化； ②砷剂选择性抑制DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，维持p16基因去甲基化状态。以上研究也表明了As2O3对U266细胞系p16细胞抑癌基因的去甲基化作用，可能为我们提供了用去甲基化药物治疗肿瘤的一个新思路。
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