EGFRvIII/PEP
作者：段小艺, 王健生, 郭佑民, 韩俊丽 王全颖, 杨广笑
【关键词】 重组基因;,EGFRvIII;,HBcAg;,原核表达;,免疫原性
Construction and prokaryotic expression of recombinant gene EGFRvIIIHBcAg and immunogenicity analysis of the fusion protein
[Abstract] AIM: To construct recombinant prokaryotic expression plasmid pET28a(+)/cPEP3c and evaluate the immunogenicity of the fusion protein. METHODS: cDNA fragment encoding PEP3 was obtained from pGEMT Easy/PEP3 and inserted into recombinant plasmid pGEMEX/HBcAg. Then it was subcloned in prokaryotic expression vector and transformed into E.coli BL21(DE3). The fusion protein was expressed by inducing IPTG and purified by Ni2+NTA affinity chromatography. BALB/c mice were immunized with fusion protein and the antibody titre was determined by indirect ELISA. RESULTS: The recombinant gene was confirmed to be correct by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. After prokaryotic expression, fusion protein existed in sediment and accounted for 56% of all bacterial lysate. The purified product accounted for 92% of all protein and its concentration was 8 g/L. The antibody titre in blood serum reached 1∶16000 after the fourth immunization and reached 1∶2.56×105 after the sixth immunization. The titre of antiPEP3 antibody reached 1∶1.28×105 and the titre of antiHBcAg antibody was less than 1∶4×103. CONCLUSION: Fusion gene PEP3HBcAg is highly expressed in E.coli BL21. The expressed fusion protein can induce neutralizing antibody with high titer and specificity, which lays a foundation for the study of genetically engineering vaccine for malignant tumors with the high expression of EGFRvIII.
[Keywords]recombinant gene; the epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII; hepatitis B core antigen(HBcAg); prokaryotic expression; immunogenicity
[摘 要] 目的: 构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒, 进行原核表达、 纯化, 观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法: 通过双酶切从pGEMT Easy/PEP3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段, 插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中, 获得重组质粒pGEMEX/cPEP3c, 将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中, 通过IPTG诱导蛋白表达, 利用Ni2+NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化; 用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠, 用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。 结果: 经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a(+)载体中, 融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%, 纯化产物占总蛋白的92%, 浓度约8 g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后, 其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000, 第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶256×105, 抗PEP3抗体滴度达到1∶128×105, 抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论: 融合基因PEP3HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达, 表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体, 从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。
[关键词]重组基因; EGFRvIII; HBcAg; 原核表达; 免疫原性
表皮生长因子受体III型突变体(epidermal growth factor receptor variant III, EGFRvIII)在多种恶性肿瘤中高表达, 它与肿瘤的发生、 有密切关系。由于EGFRvIII仅存在于恶性肿瘤组织, 为肿瘤提供了高选择性靶点, 为了探索针对EGFRvIII的基因工程疫苗,本研究在前期成功克隆编码EGFRvIII突变区PEP3抗原表位cDNA的基础上, 将编码PEP3的cDNA片段与去除了主要免疫优势区（MIR）的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)进行基因融合, 构建原核表达质粒pET28a(+)/cPEP3c, 进行原核表达和纯化, 并对表达出的融合蛋白进行免疫原性分析, 从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 重组质粒pGEMT Easy/PEP3由本实验室构建[1]; pET28a(+)质粒、 删除了HBcAg MIR区的重组质粒pGEMEX/HBcAg、 E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)、 完全弗氏佐剂、 不完全弗氏佐剂等试剂由西安华广生物工程公司提供; 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购自华美生物公司; PEP3多肽由西安蓝晶生物科技有限公司合成; Ni2+NTA His亲和层析蛋白纯化柱为Novagen公司产品; BALB/c小鼠（雌性, 6～8周龄, 质量15～20 g）购自本校医学院实验动物中心。DNA测序由上海基康生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 构建重组质粒pGEMEX/cPEP3c 用BamH I和Xho I双酶切重组质粒pGEMT Easy/PEP3及pGEMEX/HBcAg, 回收和纯化目的基因, 用T4 DNA连接酶连接载体pGEMEX/HBcAg和目的基因, 转化感受态E.coli DH5α, 挑选单菌落摇菌, 提质粒, EcoR I/Xho I酶切鉴定, 得到重组质粒命名为pGEMEX/cPEP3c。
1.2.2 构建表达质粒pET28a(+)/cPEP3c 用EcoR I和Sal I对重组质粒pGEMEX/cPEP3c和pET28a(+)进行双酶切, 回收和纯化目的片段, 进行DNA连接, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 用Kana+培养基筛选阳性克隆, 小提质粒进行酶切鉴定并测序, 对筛选出的正确的重组质粒进行大量制备。
1.2.3 重组质粒pET28a(+)/cPEP3c的原核表达 用重组质粒pET28a(+)/cPEP3c转化E.coli BL21(DE3)受体菌, 同时用空质粒pET28a(+)转化BL21菌作对照。分别挑取单个阳性菌落接种入5 mL LB培养液中, 37℃振摇培养至培养液的A600达0.4～0.6。各取2 mL培养菌液加入200 mL Kana+的LB培养液中, 振摇培养3 h, 然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 继续振摇培养8 h, 诱导蛋白表达。
1.2.4 原核表达蛋白的分离和纯化 收集细菌用裂解缓冲液和超声细胞粉碎机裂解细菌, 分别收集上清和沉淀进行SDSPAGE分析, 考马斯亮蓝染色, 观察蛋白表达。将沉淀（包涵体）充分溶解于8 mol/L尿素中, 室温16 h, 收集上清, 在含复性液的透析袋中透析48 h, 收集上清即为复性后的表达蛋白。Ni2+NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化, 操作步骤按Novagen公司纯化手册的说明书进行, 120 g/L SDSPAGE分析、 考马斯亮蓝染色, 通过凝胶扫描分析融合蛋白表达水平, 对照标准蛋白曲线, 确定融合蛋白浓度。
1.2.5 免疫动物 BALB/c小鼠11只, 于腹腔注射融合蛋白100 μL/只, 每周免疫1次, 第1次使用完全弗氏佐剂与等量融合蛋白的乳化混合物, 第2次使用不完全弗氏佐剂与等量融合蛋白的乳化混合物, 此后免疫不加佐剂而仅使用融合蛋白, 连续免疫7次。分别于初次免疫前和2次免疫后每周剪鼠尾取血。
1.2.6 间接ELISA法检测血清抗体滴度 用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释融合蛋白至5 mg/L, 包被96孔培养板, 每孔100 μL, PBS洗涤后, 加入1～11号小鼠不同稀释倍数的免疫后血清（从1∶1000开始倍比稀释）, 37℃孵育1 h, 再次洗涤后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶6000), 37℃孵育1 h, TMB显色10 min, 2 mol/L H2SO4终止反应, 酶标仪记录每孔A值, P/N>2.1为阳性标准。
1.2.7 间接ELISA法检测表达蛋白的抗原特异性 制备PEP3合成肽和HBcAg包被液, 一抗为不同稀释度的免疫后血清（从1∶1000开始倍比稀释）, 二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶6000), TMB显色10 min, 酶标仪记录每孔A600值, P/N>2.1为阳性标准。
2 结果
2.1 重组质粒pGEMEX/cPEP3c的构建与鉴定 将连接得到的重组质粒pGEMEX/cPEP3c经双酶切鉴定, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示在39 bp处可见一明显条带, 与PEP3长度一致(图1)。用DNASIS2.5软件分析可见融合的基因片段处于同一读码框内, 表明重组质粒构建成功。
图1 重组质粒pGEMEX/cPEP3c酶切鉴定 略
2.2 表达质粒pET28a(+)/cPEP3c的构建和鉴定 将EcoR I/Sal I双酶切后的pET28a(+)大片段和pGEMEX/cPEP3c小片段进行连接, 对连接产物用EcoR I/Sal I双酶切, 可切出5414 bp和484 bp两个片段, 与预测结果相吻合, 表明融合基因已插入pET28a(+)载体中（图2）; 应用DNASIS分析软件将融合基因序列与GenBank所提供的基因序列比较, 结果显示融合基因序列与设计序列完全一致。
图2 重组质粒pET28a(+)/cPEP3c酶切鉴定 略
2.3 重组质粒pET28a(+)/cPEP3c原核表达 重组质粒诱导表达后表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中, 在相对分子质量（Mr）为11500 处可见目的条带（图3）, 表达量占沉淀全菌蛋白的56%。表达蛋白经亲和层析柱纯化后, 纯化产物占总蛋白的92%, 浓度约8 g/L(图4)。
图3 融合基因诱导表达后的SDSPAGE 分析 略
2.4 间接ELISA法检测血清抗体滴度 免疫第3周有9只小鼠血清可检测到抗体, 免疫第5周所有小鼠血清中均可检测到抗体, 免疫第7周所有小鼠血清中抗体滴度均超过1∶1×105(表1), 总体抗体滴度从第4周开始迅速上升, 至第6周基本稳定（图4）。
2.5 表达蛋白的抗原性检测 经过3次免疫, 仅有3只小鼠血清中可检测到抗PEP3抗体, 检测不到抗HBc抗体, 继续强化免疫3次后, 有10只鼠免疫血清抗PEP3抗体滴度达到1∶1.28×105, 抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。
表1 间接ELISA法检测血清抗体滴度 略
图4 免疫血清抗体滴度变化趋势 略
3 讨论
近年来, 随着分子肿瘤学的, 发现了某些与肿瘤发生、 发展密切相关的受体蛋白, 由于它们高表达于肿瘤细胞, 从而为肿瘤提供了理想靶点, EGFRvIII就是其中一种。研究证实, 针对EGFRvIII的抗体、 小分子信号传导抑制剂、 特异性核酶等均显示出良好的抗肿瘤效应[2-4]。肿瘤疫苗一直是肿瘤学和免疫学领域研究的热点, 它能够重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力, 防止肿瘤细胞的入侵, 杀伤和清除体内肿瘤细胞, 并使机体产生有效而持久的免疫力, 因此对肿瘤的预防和控制具有积极作用。近年来针对肿瘤特异性抗原表位的疫苗多集中在合成肽疫苗方面, 研究表明[5], 针对EGFRvIII突变融合区的PEP3多肽耦联槭血兰蛋白（PEP3KLH）免疫动物可诱导机体产生细胞和体液免疫, 抑制高表达EGFRvIII的肿瘤细胞的增殖、 防止细胞恶性变、 延长生存时间。然而, 合成肽对技术设备要求很高, 费用昂贵, 不能化生产, 从而限制了其普及应用。为了制备针对EGFRvIII基因工程疫苗, 本实验室在前期克隆了编码PEP3的cDNA片段[1], 由于这一cDNA片段仅包含了39个碱基对, 其免疫原性弱, 在体内易被蛋白水解酶降解, 所以不适合直接作为抗原使用, 常需要和其他大分子基因(作为载体)进行融合以增强其免疫原性和在体内的稳定性。HBcAg是最常用的基因工程融合肽疫苗载体, 它不但可在细菌中高效表达并自我装配成病毒样颗粒, 而且具有很强的抗原性和免疫原性, 在人和动物中均可引起较强的免疫应答[6]。当外源基因与HBcAg的适当部位融合时, 可使外源表位暴露于病毒样颗粒的表面, 并增加其抗原性或免疫原性。HBcAg分子的刺突顶端MIR是外源性表位插入最理想的部位, 其插入的容量非常大, 外源表位插入后不但能最大限度地增强免疫原性, 而且能去除固有的HBc抗原性和免疫原性[7]。本研究室曾将β淀粉样肽基因插入HBcAg基因的MIR部位, 经原核表达获得的融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性[8]。基于此, 我们采用基因工程技术将编码PEP3 cDNA与删除了MIR区的HBcAg进行基因融合, 通过原核表达成功获得了PEP3和HBcAg的融合蛋白, 此融合蛋白能诱导机体产生显著的体液免疫, 产生高效价抗体, 进一步研究显示血清中抗体主要针对PEP3抗原表位, 抗HBcAg抗体滴度很低, 说明该融合蛋白在保持核心样颗粒结构的同时PEP3抗原表位得以暴露, 从而产生高效价的抗PEP3特异性抗体, 由于PEP3抗原表位代替了乙肝核心抗原的免疫显性区, 使HBcAg的抗原性显著下降。以上结果表明, 通过基因工程方法制备的重组融合蛋白作为肿瘤疫苗可诱导抗EGFRvIII特异性抗体的产生, 为下一步通过动物实验研究此疫苗的抗肿瘤效应奠定了基础。
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