人MUC1与GM
作者：袁时芳, 师长宏, 晏伟 姚青 李南林 王廷 王岭 张英起
【关键词】 基因工程;,MUC1;,GM
Construction and expression of eukaryotic coexpression plasmid containing human MUC1 gene and GMCSF gene
[Abstract] AIM: To construct an eukaryotic coexpression plasmid containing the coding region of human MUC1 tandem repeats gene and GMCSF gene and to identify its expression in COS7 cell. METHODS: MUC1 tandem repeats gene was obtained by synthesizing the segments. After identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing, MUC1 tandem repeats gene and GMCSF gene were cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) to construct recombinant plasmid pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF. Then the recombinant plasmid was transfected into COS7 cell by electroporation and the expression of target gene was detected by immunoflourescence and ELISA. RESULTS: Restriction analysis and DNA sequencing showed that the recombinant plasmid contained the coding region of human MUC1 tandem repeats gene and GMCSF gene. The expression of MUC1 and GMCSF was detected. CONCLUSION: The suuessful construction and expression of recombinant plasmid pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF lay a foundation for further development of DNA vaccine against breast cancer.
[Keywords]gene engineering; MUC1; GMCSF; coexpression vector; COS7 cell
[摘 要] 目的: 构建人MUC1重复序列串联体基因与GMCSF 基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF, 并观察重组质粒在COS7细胞中的表达。方法: 将信号肽及编码MUC1基因片段合成、 合成的片段经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后, 与GMCSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中, 构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF。以重组质粒转染COS7细胞, 通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果: 酶切鉴定及序列分析表明, 重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GMCSF 的融合基因, 在COS7细胞中可检测到MUC1表达, 重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GMCSF抗体。结论: 人MUC1重复序列串联体与GMCSF基因重组的真核共表达质粒的成功构建, 为对其免疫原性、 生物学特性及免疫的进一步研究奠定了基础。
[关键词]基因工程; MUC1; GMCSF; 共表达载体; COS7细胞
MUC1又名多形上皮黏蛋白 (polymorphic epithelial mucin, PEM), 是乳腺癌等多种肿瘤的分子标志物。MUC1基因的一个重要特征是其多态性(polymorphism)［1］, 即第2个外显子中含有许多连续重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR), 抗原表位即位于VNTR区。此种肽链表位在正常表达时, 被MUC1外周糖链所掩盖, 不能被识别。在癌变细胞表面, 由于糖基化不全抗原表位才得以暴露, 成为肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子。在以前的实验中, 我们发现MUC1基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CTL及体液免疫应答, 抑制小鼠乳腺癌细胞的生长［2］。巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）是目前研究最多的细胞因子之一, 其主要通过增强树突状细胞（DC）对抗原的加工和提呈而成为一种有效的免疫调节剂［3］。但GMCSF基因与MUC1基因嵌合重组后有无增强MUC1基因疫苗对乳腺癌细胞生长的特异性抑制作用, 国内外尚未见报道。本研究中, 我们成功地构建了人MUC1 VNTR串联体基因与GMCSF基因嵌合体的真核表达载体pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF, 并在COS7细胞中稳定表达, 为乳腺癌的免疫治疗研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Imperial Cancer Research Fund的TaylorPapadimitriou教授惠赠。pGEM3zf()GMCSF质粒、 COS7细胞、 pUC18载体及E.coli DH5α均由本室保存。BALB/c小鼠, 4～6 周龄, 质量15～20 g, 由本校实验动物中心提供。E.Z.N.AR plasmid Miniprep Kit 购自Omega公司; 核酸的凝胶纯化试剂盒NucleoTrapR Gel Extraction Kit购自 Clontech 公司。抗MUC1单克隆抗体（mAb）为Antibody Diagnostica 公司产品。羊抗鼠IgG FITC购自华美公司。限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司。化学试剂均为国产分析纯。小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。DMEM培养基购自GIBCO公司。RPMI1640培养液为Sigma公司产品。人GMCSF的ELISA检测试剂盒购自Clontech公司。
1.2 方法
1.2.1 MUC1重复序列串联体基因的克隆 按MUC1基因重复序列合成含带信号肽的MUC1基因单体片段, ①合成片段F1的序列为: 5′AGCTT TTC TTC CTG CTG CTG CTC CTC ACA GTG CTT ACA GTT GTT GGA TCC GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT GTC ACC TCG GCC CCG GAC ACC AGG CCG GCC CCG AGA TCT GGA G3′。F2的序列为: 5′AATTC TCC AGA TCT CGG GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC ACC GTG GGC TGG GGG GGC GGT GGA GCC GGA TCC AAC AAC TGT AAG CAC TGT GAG GAG CAG CAG CAG GAA GAA A3′。②合成片段F1与F2的退火: F1和F2用灭菌双蒸水溶解至100 pmol/μL, 取适量按常规方法沸煮2 min, 降温。③与克隆载体pUC18的连接: 将pUC18经Hind Ⅲ/和EcoR I双酶切后, 回收片段与上述退火产物在T4 DNA连接酶作用下进行连接, 并转化感受态大肠杆菌, 铺板培养。挑取单个菌落扩大培养, 提取质粒进行酶切鉴定及序列分析。④MUC1基因的串联: 将含质粒pUC18MUC1①（单体）的菌体扩大培养后, 提取质粒, 一份经BamH I/和EcoR I双切后回收小片段; 另一份经BglⅡ/和EcoR I双切后回收大片段, 将大小片段连接即得MUC1二串体（MUC1②）。同上回收pUC18MUC1②的大片段和pUC18MUC1④的小片段, 将大小片段连接后即可得到pUC18MUC1⑥, 并进行酶切及序列分析证实。
1.2.2 GMCSF基因的克隆 ①设计引物P1和P2, 并引入Linker和相应酶切位点。 P1引物的序列为: 5′ATA AGATCT GGA GGT GGA GGT AGC GCA CCC GCC CGC TCG CCC AG3′; P2引物的序列为: 5′GT GAATTC TCA CTC CTG GAC TGG CTC CCA G3′。②PCR扩增: 以P1、 P2为引物, 以本实验室保存的pGEM3zf()GMCSF为模板, 按常规进行PCR, 并回收PCR产物进行序列分析。③测序正确的PCR产物经BglⅡ/EcoR I双酶切后, 回收产物。
1.2.3 pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF的构建 ①pUC18MUC1⑥经BglⅡ/和Hind Ⅲ双酶切后, 将回收的片段与经BglⅡ/和EcoR I双酶切的GMCSF PCR产物经T4 DNA连接酶连接, 即形成pUC18MUC1⑥GMCSF的重组体。同样, 对其进行酶切鉴定及序列分析。②将h MUC1⑥GMCSF cDNA按阅读框克隆入带有CMV早期启动子的pcDNA3.1(+)真核表达载体中。以连接产物转化感受态E.coli DH5α, 挑取单个菌落并扩增, 提取质粒后进行酶切鉴定及序列测定。
1.2.4 细胞培养 将COS7细胞加入到含100 mL/L FCS的DMEM培养基中, 接种于100 mL细胞培养瓶中, 长满约75%时, 用2.5 g/L胰酶加2 g/L EDTA消化后, 以2000 r/min离心10 min。收集细胞用少量1×PBS液重悬, 调整细胞的密度为2×1010/L。
1.2.5 质粒制备和电穿孔法转染COS7细胞 小提质粒pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF及pcDNA3.1(+), 经Omega E.Z.N.A R plasmid Miniprep Kit纯化后, 用紫外分光光度法测定DNA的含量和纯度。调整DNA的浓度为1 μg/μL。将重组质粒pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF采用电穿孔法转移到COS7细胞中, 同时以pcDNA3.1(+)转染的COS7细胞作为空白对照, 以正常的COS7细胞作为阴性对照。取两种质粒各40 μg分别加入到0.8 mL细胞悬液中混匀, 移入0.4 cm穿孔杯中, 冰浴10 min, 放于电穿孔仪的正负电极之间, 电击条件为电容50 μFa, 电压450V, 电阻250Ω。电击后, 将穿孔杯继续冰浴10 min, 移入已加入含100 mL/L FCS的DMEM完全培养液的6孔培养板中, 混匀, 于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养。
1.2.6 间接免疫荧光法检测MUC1的表达 转染54 h后, 0.2 g/L EDTA消化并收集COS7细胞, 用1×PBS调整细胞为5×106～1×107/mL; 取40 μL细胞悬液加入预先加有MUC1 mAb 10 μL的5 mL离心管, 再加50 μL 1∶20稀释的灭活正常兔血清, 4℃孵育30 min, 洗涤液洗涤2次, 2 mL/次, 1000 r/min离心5 min; 弃上清, 加50 μL工作浓度的羊抗小鼠IgFITC荧光二抗, 充分振荡, 4℃孵育30 min, 洗涤液洗涤2次, 2 mL/次, 1000 r/min离心5 min; 加固定液100 μL, 制片后荧光显微镜下观察。
1.2.7 重组质粒免疫BALB/c小鼠 将10只BALB/c小鼠, 分免疫组（5只）和对照组（5只）。按每只小鼠100 μL（1μg/μL）的质粒, 肌肉注射于小鼠股四头肌肌肉丰厚处, 间隔2周注射1次, 共3次。最后1次基因免疫后第3 周, 剪鼠尾采血分离血清。
1.2.8 小鼠体内抗GMCSF抗体水平的检测 以pcDNA3.1(+)免疫血清作为对照组, 按照抗GMCSF抗体ELISA检测试剂盒的说明书进行。
2 结果
2.1 pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF的构建 以合成含带信号肽的MUC1基因单体片段F1与F2, 退火后与克隆载体pUC18的连接, 获得MUC1①（单体）。按上述方法得到MUC1⑥串体, 即pUC18 MUC1⑥。把含Linker的GMCSF PCR产物连接到pUC18 MUC1⑥的相应位点, 构建成pUC18MUC1⑥GMCSF的重组体; 再将含信号肽的MUC1⑥GMCSF克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中, 构建嵌合表达质粒pcDNA3.1(+)MUC1⑥GMCSF。
2.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF的鉴定 将重组质粒pcDNA3.1(+) MUC1GMCSF以Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切鉴定, 发现带位于800~1000 bp之间, 同预期结果(861 bp)相一致, 表明MUC1GMCSF嵌合基因已正确插入pcDNA3.1(+)载体的酶切位点之间。测序结果表明, MUC1GMCSF嵌合基因的序列正确。重组质粒pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF的酶切鉴定见图1。
图1 重组质粒pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF的酶切鉴定 略
2.3 MUC1基因在重组质粒转染COS7细胞中的表达 以活细胞间接免疫荧光法检测表明, 经pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF重组质粒转染的COS7细胞的膜及胞质中均可见明亮的荧光, 而以pcDNA3.1(+)空载体转染的细胞内未见荧光, 表明以重组质粒pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF转染的COS7细胞中有MCU1基因的表达（图2）。
图2 MUC1基因在转染COS7细胞中的表达 略
2.4 抗GMCSF抗体效价的测定 用pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF重组质粒免疫BALB/c小鼠后, 收集免疫后的血清, 检测血清中抗人GMCSF 抗体的滴度。经3次免疫后, 5只鼠中, 有2只抗体的滴度高达1∶10000, 其余3只在1∶4000~1∶6000之间, 空白对照组仅为1∶100。
3 讨论
人MUC1基因的编码产物Mucin是一种跨膜蛋白, 其多肽骨架含有空间结构稳定一致的连续重复序列(VNTR), 构成许多相同的、 重复的表位。此种肽链表位在正常表达时, 可被MUC1外周的糖链所掩盖不能被识别。在癌变细胞表面, 由于糖基化不全抗原表位才得以暴露, 从而便可诱导特异性抗肿瘤的CTL应答[4]。GMCSF主要通过增强DC对抗原的加工和递呈, 而成为一种有效的免疫调节剂［5］。Moore 等［6］研究证明, GMCSF作为HIV基因疫苗的免疫佐剂, 可诱导更强的IFNγ分泌和对HIV1 EnV抗原的特异性CTL应答。Barouch等［7］用GMCSF和gp120基因的嵌合疫苗免疫小鼠后, 可诱导较单独gp120基因疫苗免疫更强的CD4+ T细胞应答。我们以前的实验结果也表明, GMCSF佐剂有增强MUC1基因疫苗抗肿瘤细胞生长的作用［8］。目前基于MUC1靶抗原的疫苗很多。Musselli等用合成的MUC1小肽疫苗在乳腺癌患者中诱导出特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答。但是, 肽疫苗容易在体内降解。Kontani等［9］用含MUC1的DC疫苗免疫乳腺癌患者, 可诱导MUC1特异性的杀伤效应。但 DC疫苗体外操作很繁琐, 在临床广泛应用仍有明显缺陷。现有基于MUC1靶抗原的DNA疫苗多是将全长MUC1基因［10］重组入载体中, 其诱导的细胞免疫应答和保护性均有待提高。在同一载体上构建含多个基因的共表达载体, 则可提高转染和表达的效率。MUC1的多肽骨架中含有许多连续重复序列, 可非MHC限制性的活化CTL, 特异性杀伤肿瘤细胞。因此, 可设计含有一定数量连续重复序列的嵌合基因疫苗, 来诱发针对肿瘤细胞的特异性细胞免疫应答, 以消除糖基化对肽链表位免疫原性的影响来增强免疫原性。一般来说, 5~8个连续重复序列就可诱导足够强的免疫应答［4］。本研究中设计、 克隆了针对MUC1肽表位的连续重复序列, 以编码MUC1抗原表位的6个重复序列串联体基因作为靶抗原, 使抗原表位暴露保持其强的免疫原性, 从而便可提高目的基因DNA免疫诱发特异性CTL的抗肿瘤效应。另外, 可设计柔顺性好的Linker, 把MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GMCSF基因重组成为双基因多表位抗原, 通过GMCSF的免疫调节来增强其免疫原性。我们将携带胞外分泌信号序列的人MUC1重复序列串联体基因与GMCSF 基因重组后, 克隆入带有CMV早期启动子的pcDNA3.1(+)真核表达载体中, 并成功表达, 为对其免疫原性、 生物学特性及乳腺癌免疫的进一步研究奠定了基础。
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