抗人羧酸酯酶
作者：武正华, 唐晓波, 王志刚, 纪宏宇, 于磊, 刘慧文, 朱大岭
【关键词】 人羧酸酯酶
Preparation and characterization of monoclonal antibody against human carboxylesterasesⅡ
[Abstract]AIM: Topreparemonoclonalantibody(mAb) against human carboxylesterasesⅡ (hCEⅡ) and characterize its properties. METHODS: BALB/c mice were immunized with human liver microsome protein which contained hCEⅡ. The mAb was prepared by hybridoma technique and purified by proteinG affinity chromatography. The titer and specificity of mAb was detected by ELISA and Western blot respectively. Tissue localization of antigen was detected by immunohistochemical staining. Antigen was appraised by peptide mass fingerprint (PMF) matched with Mascot human protein database. PMF was obtained by immunoprecipitation and matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS). RESULTS: One clone of hybridoma secreting specific mAb against hCEⅡ was obtained. The Ig subclass of the mAb was IgG1(κ). The titer of the mAb was 1×10-7. Western blot analysis showed one clear belt in the Mr of 62000. Immunohistochemistry demonstrated that the mAb had special combination with the liver cytoplasm protein, but not with the vascular smooth muscle cell protein. Immunoprecipitation showed one clear band in the Mr of 62 000, which was in conformity with the Mr of hCEⅡand the antigen was confirmed to be hCEⅡafter being analyzed with mass spectrometry. CONCLUSION: The mAb against hCEⅡwith high titer and specificity has been obtained, which lays the foundation for investigation of hCEⅡ function and diagnosis and therapy of liver cancer.
[Keywords]human carboxylesterasesⅡ; monoclonal antibody; matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry
[摘 要] 目的: 制备鼠抗人羧酸酯酶Ⅱ（human carboxylesterasesⅡ, hCEⅡ）单克隆抗体（mAb）并对其特性进行鉴定。方法: 以含hCEⅡ的人肝脏微粒体蛋白混合抗原免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备鼠抗hCEⅡ的mAb, 并用ProteinG亲和层析法纯化mAb。用间接ELISA法测定mAb的效价, 以Western blot鉴定mAb的特异性、 免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位。用免疫沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry, MALDITOFMS）得到相应的肽质量指纹谱（peptide mass fingerprint, PMF）, 再通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原。结果: 获得1株可持续、 稳定分泌抗hCEⅡ的mAb的杂交瘤细胞系。杂交瘤细胞分泌的mAb Ig的亚类（型）为IgG1（κ）, 腹水mAb的效价达1×10-7。Western blot分析显示, 在Mr为62000处有1条清晰的带。免疫组化染色显示, 该mAb可与肝细胞的浆蛋白结合（hCEⅡ存在于肝细胞浆内微粒体）, 而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合。该mAb免疫沉淀物的Mr为62000, 与hCEⅡ的Mr相符。对免疫沉淀的蛋白质进行质谱鉴定证实, 该mAb对应的抗原为hCEⅡ。结论: 制备出的鼠抗hCEⅡ的mAb效价高、特异性良好,为进一步研究hCEⅡ的功能及其在肝癌等癌症的诊断和中的作用提供了工具。
[关键词]人羧酸酯酶Ⅱ; 单克隆抗体; 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
在蛋白质组学研究中, 单克隆抗体（mAb）及其相关技术在蛋白质分子的定性、 定量、 定位、 蛋白翻译后修饰及蛋白蛋白相互研究中具有不可替代的作用。因而蛋白质组学的研究需要很多特异性好、 高质量的mAb。本研究描述了用混合的人肝微粒体蛋白作抗原制备其鼠源性杂交瘤的策略。mAb对应的抗原是用免疫沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）得到相应的肽质量指纹谱（peptide mass finger print, PMF）, 再通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定的。人羧酸酯酶Ⅱ（carboxylesterasesⅡ, EC 3.1.1.1, hCEⅡ）是羧酸酯酶亚家族中的成员, 由550个氨基酸组成, 相对分子质量（Mr）为61807。羧酸酯酶属于B族脂酶, 为一种丝氨酸酶, 在肝脏、 小肠、 结肠、 心脏、 脑、 睾丸及肾脏等组织中均有表达。血清中的hCEⅡ主要在肝脏中合成, 并通过高尔基体分泌到血循环中[1]。最近研究表明, hCE可作为肝癌的新标志物[2]。由于目前国际市场上还没有抗hCEⅡ的mAb的销售, 为此, 我们应用杂交瘤技术, 制备了抗hCEⅡ的mAb, 并进行了特性鉴定, 为hCEⅡ的纯化, hCEⅡ检测试剂盒的研制, 后续制备mAb亲和层析柱, 以及肝癌等的研究提供了重要的制剂。
1 材料和方法
1.1 材料 6周龄雌性BALB/c小鼠, 由哈尔滨医科大学动物中心提供。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0为本室保存。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）购自Sigma公司。即用型SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。HRP山羊抗小鼠IgG购自Jackson ImmunoResearch公司。RPMI1640培养基购自Hyclone公司。PEG4000购自北京夏斯生物公司。Ig亚类鉴定试剂盒购自HyCult biotechnology bv公司。免疫沉淀试剂盒购自PIERCE公司。硝酸纤维素膜购自BIORAD公司。加强化学发光试剂盒（ECL Plus）购自Amersham Biosciences公司。其他试剂均为国产分析纯。酶标仪（MK3型）为Thermo公司产品。质谱鉴定由上海基康生物技术有限公司完成。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”基金项目提供。
1.2 方法
1.2.1 人肝脏微粒体蛋白的制备 取正常人的肝脏10 g剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白, 并制成肝匀浆。将肝匀浆离心3次（依次为10000 g 30 min、 30000 g 60 min及100000 g 60 min）。取沉淀, 悬浮于含有200 mL/L甘油、 5 g/L胆酸钠、 2 mg/L抑肽酶、 2 mg/L亮肽素、 1 mg/L胃酶抑素及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的磷酸钾盐缓冲液中, 用Bradford法进行蛋白定量后, 置-80℃保存备用。
1.2.2 抗hCEⅡ的mAb的制备 采用石晓娟等[3]报道的方法（略有改进）进行免疫。取1 mg人肝微粒体蛋白加500 μL的去离子水与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于BALB/c小鼠（2只）的背部注射两点, 每点约50 μL, 剩余的腹腔注射。3周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 注射于小鼠腹腔。以后隔两周加强免疫1次。从第3次加强免疫起, 每次免疫后7 d, 经尾静脉采血测定抗血清的效价。共加强免疫4次后, 选择抗血清效价较高的小鼠, 在进行细胞融合前3 d, 用不加佐剂的人肝微粒体蛋白腹腔注射冲击免疫1次。细胞融合、 亚克隆及腹水的制备均按实验室常规方法进行。mAb腹水的纯化采用ProteinG免疫亲和层析法[4], 用 Amersham AKTAprime mAb纯化系统进行。纯化后mAb经SDSPAGE分离后, 用BIORAD quantity one软件分析其纯度。
1.2.3 mAb的特性鉴定 ①效价测定: 采用间接ELISA法。以1 mg/L人肝微粒体蛋白包被酶标板, 依次加入不同浓度的腹水及1∶3000 HRP山羊抗小鼠IgG, 加TMB显色后, 用酶标仪测定A450值。②Ig类和亚类的鉴定: 按Ig亚类鉴定试剂盒的说明书进行。③特异性鉴定: 采用Western blot分析。取上述制备的人肝微粒体蛋白50 μg进行SDSPAGE分离并电转移至硝酸纤维素膜上。滴加脱脂奶粉封闭（室温1 h）后, 依次加mAb（4℃过夜, 洗膜3次）及1∶10000 HRP山羊抗小鼠IgG（室温孵育1 h, 同上洗涤）。将硝酸纤维素膜用ECL Plus处理5 min后, 于暗室曝光到X胶片上, 显影、 定影。
1.2.4 人肝组织中hCEⅡ抗原的免疫组化染色检测 载玻片经防脱片剂处理。将正常人肝脏的组织冰冻切片于室温风扇吹干后, 用丙酮室温固定10～30 min, 蒸馏水洗。将切片浸于300 mL/L H2O2甲醇(1∶50)液中, 于室温浸泡30 min灭活内源性过氧化物酶, 以蒸馏水洗3次。滴加正常山羊血清室温封闭20 min后, 依次滴加mAb（37℃ 1 h, PBS洗3次）、 生物素化山羊抗小鼠IgG（37℃ 20 min, PBS洗3次）及链酶亲和素过氧化物酶复合物（SABC, 同前次）。加DAB显色后, 再加苏木精复染细胞核, 经常规脱水、 透明、 封片, 观察结果。
1.2.5 肝微粒体蛋白抗原的鉴定 ①免疫沉淀法:按PIERCE公司试剂盒的说明书进行。②免疫沉淀后Western blot分析: 将以30 μL 2×上样缓冲液悬浮的人肝微粒体蛋白（抗原）、 用mAb进行免疫沉淀形成的抗原抗体复合物和纯化后的抗hCEⅡ mAb（纯化后的抗hCEⅡ mAb作为抗原虽不能与一抗mAb结合但可与二抗结合而显色）于95℃加热5 min, 置于冰上冷却10 min。将上述3种样品经10 g/LSDSPAGE分离后, 电转移至硝酸纤维素膜上, 以后的步骤均同特异性鉴定。③考马斯亮蓝染色法: 将上述3种样品经10 g/L SDSPAGE分离后, 用考马斯亮蓝染色。脱色后, 切下抗原抗体复合物泳道中与抗原泳道相对应而与mAb泳道不对应的蛋白带, 即为此mAb对应的抗原。④质谱鉴定: 用胰酶对免疫沉淀凝胶上的抗原蛋白, 于精氨酸或赖氨酸的C末端处进行断裂（其相邻氨基酸为脯氨酸时除外）。断裂后所产生的蛋白的Mr通过MALDITOFMS测量, 即得到相应的PMF数据, 通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原[5, 6]。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 按常规方法融合、 间接ELISA法筛选及3次亚克隆后, 得到1株可持续、 稳定分泌抗hCEⅡmAb的杂交瘤细胞系株（21D9）, 经体外连续传代培养, 液氮冻存半年以上, 复苏后仍生长良好, 说明其分泌mAb的性能稳定。
2.2 mAb的纯化及纯度鉴定 采用ProteinG免疫亲和层析法纯化mAb腹水后, 经SDSPAGE分离表明, 出现一条Mr约为55000 的带（重链）, 另一条Mr约为25000的带（轻链）, 未见其他的带（图1）。用BIORAD quantity one软件分析其纯度为96%, 为后续制备mAb的亲和层析柱提供了保障。
图1 抗hCEⅡ mAb的SDSPAGE分析（略）
Fig 1 SDSPAGE analysis of mAb against hCEⅡ
M: Protein marker; 1: Purified mAb.
2.3 抗hCEⅡ mAb的特性鉴定 ①效价测定: 间接ELISA检测表明, 腹水mAb的效价达1×10-7。②Ig亚类及型的鉴定: 用Ig亚类鉴定试剂盒检测表明, 该mAb为IgG1（κ）。③特异性鉴定: 以制备的人肝脏微粒体蛋白作为抗原, 以抗hCEⅡ mAb作为一抗, 进行还原及非还原性Western blot分析。结果显示, mAb与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为62000处出现1条清晰的带, 与hCEⅡ的Mr相符（图2）, 说明所制备的mAb能与还原及非还原的人肝脏中的羧酸酯酶结合。
图2 抗hCEⅡ mAb特异性的还原与非还原条件下Western blot分析（略）
Fig 2 Analysis of anti hCEⅡ mAb specificity by reducing and nonreducing Western blot
M: Protein marker; 1: Nonreduced hCEⅡ in human liver; 2: Reduced hCEⅡ in human liver.
2.4 肝细胞浆蛋白的免疫组化染色检测 免疫组化染色的结果显示, 在1000倍光镜下, 可见抗hCEⅡmAb与肝细胞的浆蛋白结合（hCEⅡ存在于肝细胞质内微粒体。图3箭头1为阳性区, 箭头3为肝细胞核）, 而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合（图3箭头2阴性区, 箭头4为平滑肌细胞核）, 表明人肝细胞的浆蛋白中含有hCEⅡ抗原。
图3 人肝组织中hCEⅡ抗原的免疫组化染色检测（略）
Fig 3 Detection of hCEⅡ antigen in human liver tissue by immunohistochemical staining(×1000)
2.5 人肝微粒体蛋白抗原的鉴定 ①Western blot分析: 以制备的人肝微粒体蛋白（抗原）、 用mAb进行免疫沉淀形成的抗原抗体复合物和纯化后的抗hCEⅡmAb分别作为抗原, 以mAb作为一抗进行Western blot分析。结果显示, mAb与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为62000处出现1条清晰的带, 与hCEⅡ的Mr（为61807）相符。mAb与其免疫沉淀形成的抗原抗体复合物, 分别在Mr约为62000、 55000、 25000处出现3条清晰的带, 分别与hCEⅡ、 IgG的重链及轻链分子量相符。以纯化后的抗hCEⅡmAb作为抗原, 虽不能与一抗mAb结合但可与二抗结合而显色, 因而在Mr约为55000处出现1条清晰的带, 与抗体重链的Mr相符（图3）。以上说明, 与mAb相对应抗原的Mr约为62000。②质谱鉴定: 免疫沉淀产物经SDSPAGE分离后作考马斯亮蓝染色, 将凝胶上抗原蛋白带切下做质谱分析表明, 该人肝微粒体蛋白抗原为hCEⅡ（图4、 5、 6）。
图4 免疫沉淀后所获蛋白的Western blot分析（略）
Fig 4 Analysis of protein obtained after immunoprecipitation by Western blot
M: Protein marker; 1: Human liver microsome protein; 2: Protein obtained after immunoprecipitation; 3: AntihCEⅡ mAb.
图5 人肝脏微粒体蛋白抗原与hCEⅡ的氨基酸序列比较（略）
Fig 5 Comparison of amino acid sequences between human liver microsome protein antigen and hCEⅡantigen
Matched peptides were shown in underline. The protein obtained after immunoprecipitation was cleavaged by Trypsin: Cterm side of lysine or arginine was cut unless next residue is proline. Number of mass values searched: 55. Number of mass values matched: 13. Sequence coverage: 27%.
图6 Mascot在人类蛋白质数据库中检索的结果（略）
Fig 6 The result of probability based Mascot
Top score: 99. Score is －10×Log (P), where P is the probability. Protein scores greater than 64 are significant (P<0.05).
3 讨论
以粗制的人肝脏微粒体蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠, 按常规方法融合, 用间接ELISA法筛选及3次亚克隆后, 得到1株可持续、 稳定分泌抗hCEⅡ的mAb的杂交瘤细胞系。mAb的腹水经ProteinG亲和层析纯化后, 纯度达96%。间接ELISA测定表明, mAb腹水的效价达1×10-7。Western blot分析表明, 制备的mAb与人肝脏微粒体蛋白在Mr约为62000处出现1条清晰的带, 与羧酸酯酶的Mr相符, 表明该mAb为抗人肝微粒体蛋白的抗体。还原及非还原性Western blot分析还表明, 该mAb能与还原及非还原的人肝微粒体蛋白结合, 提示此mAb与人肝微粒体蛋白相结合的抗原表位是线性的, 且位于此蛋白的表面。另外, 免疫组化染色显示, 该mAb只与肝细胞的浆蛋白特异性结合（hCEⅡ存在于肝细胞浆内微粒体）, 而不与血管平滑肌细胞内蛋白结合, 与[7]的报道一致。为了确定该mAb识别的抗原是否为hCEⅡ? 我们用免疫沉淀及MALDITOFMS得到相应的PMF数据。通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定出mAb对应的抗原为hCEⅡ。迄今, 还没有纯化出天然的hCEⅡ。以往研究表明, hCEⅡ的亚细胞分布具有明显的差异性, 在人肝、 肾及脑等组织中, hCEⅡ主要位于微粒体的可溶性部分[7]。根据这一特点, 我们采用蔗糖密度梯度离心法, 用正常人肝脏组织制备含有天然hCEⅡ的人肝微粒体蛋白混合抗原。这样, 便可在没有天然hCEⅡ抗原的情况下, 制备出效价高、 特异性良好的抗天然hCEⅡ的mAb。抗hCEⅡ的mAb在蛋白质组学中具有重要的作用。另外, 由于hCEⅡ可促进依立替康、 卡培他滨等抗癌药的代谢[8, 9], 因而, 抗hCEⅡmAb的制备, 对于增强抗癌药物的疗效也具有重要的作用。最近研究表明, hCE可作为肝癌的标志物[2]。为此, 抗hCEⅡmAb的制备, 对建立检测hCEⅡ的方法, 精确分析其在肝癌组织及血清中的含量也具有重要的意义。
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