青藤碱对大鼠心脏移植排斥反应期间ICAM

              作者：杨帆, 季刚, 陈彦彬, 王为忠 

【关键词】  心脏移植;,青藤碱;,移植物排斥;,大鼠

　　The effects of sinomenine on the expresssion of ICAM1 and IL2 during the rejection of rat cardiac allograft

　　[Abstract]  AIM: To observe the pathological characteristics of the rejection of rat cardiac allograft, study the effects and mechanisms of sinomenine on the rejection of rat cardiac allograft. METHODS: The rat model of heterotopic cardiac allograft was established. The rats were  randomly divided into four groups: Group A(control group of healthy SD rats), Group B (cardiac allograft of SD to SD rats), Group C (cardiac allograft of SD to Wistar rats) and Group D (sinomenine treated group of cardiac allograft of SD to Wistar rats). ELISA and immunohistochemical staining were carried out to estimate the expression level of IL2 and ICAM1 in the grafts. RESULTS: Little ICAM1 and IL2 was observed in both Group A and Group B and the infiltration of lymphocytes was not so obvious. In group C, ICAM1 and IL2 were increased significantly and the infiltration of lymphocytes was obviously.  In group D, inflammatory reaction and infiltration of lymphocytes were much less than those in group C, and ICAM1 and IL2 is expressed weakly. CONCLUSION: The expression level of ICAM1 and IL2 was relevant to the occurrence and development of graft rejection. Sinomenine could obviously reduce the expression of intercellular adhesion molecule and the infiltration of lymphocytes in the grafts and prolong grafts survival significantly.

　　[Keywords]heart transplantation; sinomenine; graft rejection; rat

　　[摘 要]  目的: 观察大鼠同种异位心脏移植排斥反应期间的病理特征, 探讨青藤碱对大鼠心脏移植排斥反应的影响及其发生机制。方法: SD 健康大鼠为供体, Wistar大鼠为受体, 建立大鼠异位心脏移植模型。实验分4组: A组为健康SD大鼠心脏作对照组, B组为SD 大鼠到SD 大鼠的同基因移植组, C组为SD大鼠到Wistar大鼠异基因移植组, D组为清藤碱组。以ELISA、 免疫组织化学检测移植心组织中IL2和ICAM1的表达。结果: A、 B组未见排斥反应发生, 心脏组织中的ICAM1和IL2表达水平很低; C组有明显的炎症反应并见大量淋巴细胞浸润,  组织中ICAM1和IL2的表达水平明显升高(P<005); D组炎症反应有所减轻, 同时少有淋巴细胞浸润; 组织仅微弱表达ICAM1和IL2。结论: 移植心脏ICAM1和IL2的表达水平与排斥反应的发生和有关, 青藤碱能显著抑制移植心ICAM1和IL2的表达和淋巴细胞的浸润, 减轻排斥反应, 明显延长移植物的存活。

　　[关键词]心脏移植; 青藤碱; 移植物排斥; 大鼠

　　青藤碱(sinomenine, SIN)是从中药青风藤中提取的一种单体生物碱, 具有抗炎、 抗风湿、 免疫抑制、 镇痛、 镇静等多方面的药理作用[1], 临床用于治疗类风湿性关节炎等身免疫性疾病疗效较好, 且副作用小[2]。为了进一步证实SIN的免疫抑制作用, 探讨SIN 免疫抑制作用机制, 为SIN的深层次开发及在器官移植免疫抑制治疗上的应用提供理论依据, 以期SIN 的使用减少CsA 的用量而减轻其毒副作用。我们通过建立大鼠心脏移植模型, 研究SIN 对移植心脏影响及机制, 为青藤碱深层次开发应用提供实验依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  健康雄性SD大鼠(质量250～280 g)30只, 为心脏移植供体; 健康雄性Wistar大鼠(质量230～250 g)30只, 为心脏移植供体, 均购自第四军医大学实验动物中心。青藤碱盐酸盐粉剂, 购自正清股份有限公司; 检测IL2的ELISA试剂盒购于美国Biasouse公司; ICAM1免疫组化试剂盒购于北京中山公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  大鼠心脏移植急性排斥反应模型的建立  SD大鼠作为移植心脏供者, Wistar大鼠为受体参照Ono等[3]的方法, 并加以改进。供体麻醉后, 剪开胸腔, 迅速游离升主动脉及肺动脉, 并将之分别剪断, 其余与心脏相连的组织作一束结扎。取下供心后迅速置入4℃冷盐水中备移植。受体麻醉后开腹, 采取腹腔内异位心脏移植法。于肾动、 静脉下方将供心升主动脉对受体腹主动脉、 供心肺动脉对受体下腔静脉, 用110 显微缝线作端侧连续缝合。缝合完毕开放阻断钳, 移植心即刻恢复跳动。移植术后观察可经腹部扪摸心搏动, 确定移植心是否存活。饲养, 环境温度控制在22～25℃, 自由饮水。

　　1.2.2  实验分组  健康SD大鼠心脏作A组（对照组）, 给予普通饲料喂养; 移植成功的心脏移植受者鼠; 按随机原则分成3组, B组（SD大鼠到SD大鼠的同基因移植组）, 术后3 d予以氨苄青霉素200 mg/kg, iv, 1次/d; C组（SD大鼠到Wistar 大鼠异基因移植组; 术后处理同B组; D组（行不同品系心脏移植SD→Wistar）, 术后3 d予以氨苄青霉素200 mg/kg, iv, 1次/d+青藤碱30 mg/(kg・d), iv, 1次/d。

　　1.2.3  移植心搏动强度观察  术后每天腹部触诊, 判定移植心搏动强度。将移植心搏动强度分为5 级: Ⅰ级为移植心无搏动; Ⅱ级为移植心有微弱搏动; Ⅲ级为移植心搏动弱, 需稍用力方可触及; Ⅳ级为移植心搏动较强, 轻触腹部即可触及; Ⅴ级为移植心搏动强, 将鼠置于仰卧位即可见心脏搏动。

　　1.2.4  细胞因子的测定及移植鼠存活时间的测定  术后第3、 5、 7天, 从每组中随机抽取9只受体鼠采血2 mL。第7天处死移植鼠取移植心, 甲醛固定, 送病理检查。另取移植心脏组织快速冷冻后切片, 以免疫组化检测ICAM1的表达。ELISA法检测血清中的IL2, 具体操作按试剂盒说明书的实验操作流程进行。每组余下的6只受体鼠继续饲养, 观察生存时间。

　　1.2.5  排斥反应的诊断和分级  采用Stanford 标准[4]排斥反应程度分级: (1)0级:无排斥; (2)1级: 1A: 个别淋巴细胞浸润1B: 散在少量的淋巴细胞浸润; (3)2级: 单灶性侵袭性淋巴细胞浸润或伴有灶性心肌细胞损害; (4)3级: 3A: 多灶性侵袭性淋巴细胞浸润或伴有心肌细胞损害; 3B: 弥漫性炎症伴有心肌坏死; (5)4级: 弥漫性多类型细胞浸润伴有出血水肿和坏死。

　　1.2.6  统计学处理  各组移植心脏存活时间、 ICAM1和IL2表达的数据, 利用SPSS100统计软件用卡方检验进行差异显著性分析, 以P<005为具有统计学意义。所得数据采用x±s表示。

　　2  结果

　　2.1  心脏移植受体鼠存活时间  A组(n=6)存活时间不受限制; B组(n=6)受体平均存活时间为(30±15)d; C组(n=6)受体为(70±1)d; 和C组相比, D组(n=6)受体为(120±12)d(P<005)延长了受体鼠的存活时间。其中C组与A, B, D组相比存活时间明显缩短(P<005) 。

　　2.2  病理改变  在术后第7天采集移植心脏组织, 肉眼观: A组心脏形态正常, 触诊搏动强度为Ⅴ级; B组移植心红润, 触诊搏动强度为Ⅳ级; C组肉眼观察移植心有不同程度的肿大, 质地变硬, 呈暗红色或黑色, 与周围中度粘连, 呈急性排斥表现, 触诊搏动强度为Ⅱ级; D组移植心颜色深红, 有少量炎性渗出液, 与周围轻度粘连, 触诊搏动强度为Ⅱ级。 HE 组织切片, 镜下观察: A组心肌结构正常; B组移植心脏心肌结构正常, 间质有少量淋巴细胞浸润, 无急性排斥反应表现; C组心肌组织内有大量淋巴细胞和单核细胞浸润, 末梢小血管内血栓形成, 明显的心肌间质水肿和出血, 不同程度的心肌细胞变性坏死、 心肌间质纤维素渗出等血管内皮细胞损伤后的继发表现, 呈急性排斥变化; D组见血管轻度扩张渗血, 少量中性粒细胞、 淋巴细胞、 单核细胞浸润, 间质少量细胞浸润, 伴有灶性心肌细胞损害, 表明心脏移植的急性排斥反应受到抑制。

　　2.3  ELISA法检测移植大鼠血清IL2的表达  A组IL2表达水平极低, 而且无明显变化; B组和D组IL2术后表达水平高于A组（P<005, 表1）, C组IL2表达明显升高, 与其他组相比差异有统计学意义（P<005）。

　　表1  大鼠心脏移植术后血清中IL2浓度的变化（略）

　　Tab 1  The level change of IL2 after rat cardiac allograft

　　aP<0.05 vs group A and B; cP<0.05 vs group D.

　　2.4  移植心脏组织中的ICAM 1的表达分析  免疫组化结果在放大200倍的显微镜下摄取图象, 用MPIAS2500多媒体彩色图文分析系统测量光密度值, 然后光密度值的均值作为此组的代表值。A和B组移植心脏组织ICAM1的表达微弱, C组可见移植心毛细血管内皮细胞ICAM1表达明显（图1A）, 与AB组比较, 差异有显著性(P<005, 表2)。D组移植心ICAM1的表达微弱(图1B), 与C组对照比较, 差异有显著性(P<005)。各组移植心肌组织ICAM1的表达灰度分析值见表2 。

　　图1  大鼠心脏移植后心脏组织中ICAM1免疫组化染色结果（略）

　　Fig 1  The immunohistochemical result of expression of ICAM1 in the allograft (×200)

　　表2  各组大鼠心脏组织中ICAM1的表达灰度分析（略）

　　Tab 2  Ananlysis of ICAM1 average gray scale in each  rat cardiac allograft group

　　aP<0.05 vs group A and B; cP<0.05 vs group D.

　　3  讨论

　　大鼠心脏移植模型广泛应用于急、 慢性排斥反应机理、 免疫耐受、 免疫排斥反应监测、 抗心脏移植排斥反应药物选择等临床基础实验研究[5], 排斥反应是心脏移植失败的主要原因。ICAM1在组织内分布广泛, 且与MHCⅡ类抗原的分布范围一致, 正常情况下ICAM1很少表达或不表达, 排斥反应期间ICAM1表达增加[6, 7]。本研究结果提示, Wistar大鼠接受SD 大鼠的心脏移植后, C组移植心组织的ICAM1表达水平明显升高, 主要表达在移植心组织的血管内皮细胞。排斥反应期间ICAM1 的表达水平明显升高, 提示ICAM1的表达水平与排斥反应的强弱有关。同种异体移植物植入受体后, 由于供、 受体MHC编码的抗原不同, 诱发T细胞增殖、 活化, 生成CTL, 攻击破坏移植物,产生排斥反应。IL2的表达水平与排斥反应的强弱有关, 青藤碱对排斥反应具有显著的抑制作用[8, 9]。本研究中我们观察到: 青藤碱组（D）受体平均存活时间为(120±12)d, 较C组平均存活时间(70±1)d明显延长; 同时, 移植心脏病理组织学结果显示, D组有部分受体于术后7 d出现轻度急性排斥反应, 而C组术后7 d全部出现中、 重度急性排斥反应; D组术后IL2表达（170±001 μg/L）低于C（620±001 μg/L）; D组ICAM1表达水平（14762±561）低于C组（19343±1227）, 这表明, 心脏移植后, 青藤碱可明显降低受体的免疫细胞的活性, 减少急性排斥反应的发生。本研究观察到青藤碱具有抗排斥作用, 并从细胞因子方面对其免疫抑制机理作了探讨。我们认为青藤碱可从多环节抑制急性排斥反应, 其作用机制仍有待进一步的研究。

　　:

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