β，β
作者：裴凌鹏，董福慧，惠伯棣，朱佳
【关键词】 成骨细胞；超氧化物歧化酶；膜流动性；β,β
摘要：目的 研究β，β胡萝卜素增强成骨细胞抗自由基损伤的作用。方法 用H2O2作用M3T3E1成骨细胞，建立自由基损伤细胞模型。培养的成骨细胞分为对照组、模型组、β，β胡萝卜素低剂量组(1×10-8mol/L)、β，β胡萝卜素中剂量组(1×10-7mol/L)和β，β胡萝卜素高剂量组(1×10-6mol/L)。测定不同处理组细胞活力、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、活性自由氧(reactive oxygen species, ROS)含量、脂质过氧化物(lipid oxygen, LPO)含量，同时利用荧光偏振法测定细胞膜流动性。结果 模型组细胞活力、SOD活性、细胞膜流动性均比不同β，β胡萝卜素剂量组有显著降低(P<0.01)，而ROS、LPO含量均比不同β，β胡萝卜素剂量组有显著升高(P<0.01)。结论 H2O2摄入会导致成骨细胞的氧化损伤，而β，β胡萝卜素可以预防或降低此类损伤对细胞的影响。
关键词：成骨细胞；超氧化物歧化酶；膜流动性；β，β胡萝卜素
Effect of β, βcarotene in improving H2O2 induced damage of osteoblasts
ABSTRACT: Objective To investigate the effect of β, βcarotene in enhancing the function of antioxidative damage in osteoblasts. Methods M3T3E1 osteoblasts were randomly divided in five groups: control group, model group, and β, βcarotene group [lowdose (1×10-8mol/L), mediumdose (1×10-7mol/L), highdose (1×10-6mol/L)]. The activity of cells, superoxide dismutase (SOD), the content of reactive oxygen species (ROS), lipid oxygen (LPO), and membrane fluidity were tested and compared. Results Compared with those in β, βcarotene groups, the activity of cells, SOD activity and membrane fluidity in the model group were significantly decreased (P<0.01). However, the content of ROS and LPO was significantly raised(P<0.01). Conclusion H2O2 can cause oxidative damage of M3T3E1 osteoblasts, but β, βcarotene can prevent and decrease its influence.
KEY WORDS:osteoblast; superoxide dismutase; membrane fluidity; β, βcarotene
β, β胡萝卜素(β, βcarotene)是一种类胡萝卜素，其习惯命名为β胡萝卜素，分子式为C40H56，只由碳氢两种元素组成，其分子由中央多聚烯链和两端的芳香环末端基团组成，为双环结构，整个分子呈几何中心对称。β, β胡萝卜素在界中广泛存在，如番茄、西瓜、葡萄柚等。研究发现β, β胡萝卜素具有多种生物学活性，其中以抗氧化、防止心血管疾病、提高机体免疫力和抗癌作用尤为突出[12]。β, β胡萝卜素对成骨细胞抗氧化损伤的相关研究国内尚未见报道。因此，针对此类领域的研究具有一定的意义。本实验通过β, β胡萝卜素对H2O2氧化损伤M3T3E1成骨细胞模型的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、活性自由氧(reactive oxygen species, ROS)含量、脂质过氧化物(lipid oxygen, LPO)含量以及细胞膜流动性的测定，并与模型组进行比较来研究此类化合物对增强成骨细胞对抗H2O2氧化能力的影响。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 Labconco冰冻真空干燥仪(法国乐高公司)，752分光光度计、AE100天平(伯乐公司)，电热三用水箱、KA1000型台式离心机(杭州华亭公司)，960型荧光分光光度计、J2SH高速冰冻离心机(日本岛津公司)，C30柱(YMC Carotenoid S5, Waters)，HPLC(Waters 600E溶剂输送系统，PDA2996二极管阵列检测器Waters)，CO2细胞培养箱(Precision Scientific公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS)，LPO、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，β, β胡萝卜素纯品乳化剂(瑞士罗氏公司)，乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)(迪马公司)，无水乙醇(北京化学试剂公司)，大孔吸附树脂(天津农业股份公司)，α低渗培养基(αMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清为Gibco公司产品，1,6二苯基1,3,5己三烯 (DPH)、二氯荧光素(DCF)、四氢呋喃 (THF) 购自Sigma公司。
1.2 乳化剂破乳制备β, β胡萝卜素
1.2.1 有机试剂萃取 称取10g乳化颗粒加入少许水，超声波促溶后，加入300mL丙酮正己烷(3∶2)萃取。静置2h后，将脂溶性相收集(反复萃取直至水相成无色)，再利用减压旋转蒸发仪进行提取液浓缩处理。
1.2.2 β, β胡萝卜素提取液柱色谱纯化 ①装柱：将活化好的氧化铝装填于玻璃层析柱中，装填高度为12cm，用正己烷润湿。②洗脱：分别取2mL β, β胡萝卜素提取液上柱，用50mL正己烷丙酮(10∶1)淋洗，收集洗脱液。将洗脱液用氮气吹干制粉，装入充满氮气的玻璃瓶内，-70℃储存备用。
1.3 β, β胡萝卜素鉴定 根据其高效液相色谱(HPLC)中保留时间和紫外可见吸收光谱的特征峰与标准品对照进行鉴定，得到的β, β胡萝卜素提取液经过微膜过滤后用HPLC分离。色谱条件：色谱柱：Waters YMC Carotenoid S5(4.6×250mm)；流动相A：乙腈甲醇(75∶25);流动相B：MTBE；流动相A与B中分别加入0.5g/L三乙胺作为改性剂防止β, β胡萝卜素降解；线性梯度洗脱：B在8min内由0%增加至55%, 8-35min B维持55%, 35-40min B由55%减至0%；流速：1.0mL/min；检测波长：475nm，波长范围260-700nm；进样量：20μL。并收集后观察其光谱特征峰行为。
1.4 成骨细胞实验
1.4.1 成骨细胞培养 将M3T3E1成骨细胞复苏后，用含10%(体积分数)胎牛血清的αMEM培养液重悬吹打均匀后，以每孔1×105个/mL细胞密度接种于培养板中，在37℃，5%(体积分数)CO2条件下培养，隔日换液，以后每隔2d换液1次，细胞融合后，用2.5g/L胰蛋白酶消化、传代，相差显微镜下观察成骨细胞形态。
1.4.2 成骨细胞分组处理 将成骨细胞分为对照组、模型组、高、中、低不同剂量β, β胡萝卜素组。对照组和模型组使用正常培养液进行培养，而高、中、低不同剂量β, β胡萝卜素组分别用含有1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L的β, β胡萝卜素培养液培养。48h后除对照组外均用1×10-5mol/L的H2O2进行处理5min，离心去掉上清液备用。
1.4.3 细胞活力测定 以αMEM为培养液，细胞密度1×105个/mL。收集处理后的细胞，台盼蓝染色观察细胞存活率。αMEM洗涤2次后重悬细胞，加入100g/L Alamar Blue。37℃、5%(体积分数)CO2培养4h。用酶标仪分别于540nm和620nm测定吸光度，并按下列公式1,2还原率。公式1：还原率(%)=(A540-A620×R)×100；公式2：R=(AA540-AR540)/(AA620-AR620)(AA540：波长540nm时Alamar Blue对照的吸光度；AR540：波长540nm时αMEM对照的吸光度；AA620：波长620nm时Alamar Blue对照的吸光度；AR620：波长620nm时αMEM对照的吸光度；A540：波长540nm时样品的吸光度；A620：波长620nm时样品的吸光度)。
1.4.4 ROS测定 以磷酸缓冲液(PBS)调节细胞浓度为1×105/mL左右，加入5μmol/L二氯荧光素(DCF)预处理细胞1h。H2O2处理后，荧光分光光度计激发光485nm、狭缝5nm、发射光530nm、狭缝10nm，测定各组细胞悬液及无细胞对照组中DCF的荧光强度。
1.4.5 SOD活性及LPO测定 收集处理后的细胞，PBS洗涤2次，-70℃反复冻融3次，4℃、10000r/min离心20min，取上清。Nitrite法测定SOD活性，TBA荧光法测定LPO，考马斯亮兰G250测定蛋白质水平校正SOD及LPO值。
1.4.6 成骨细胞膜分离 成骨细胞溶于pH 7.4的10mmol/L TrisHCl低渗缓冲液中，4℃静置3h，不停搅拌，7000r/min离心20min，将沉淀物再加入低渗缓冲液，10000r/min离心15min，得到白色的细胞膜组织。封闭影泡制备：白色细胞膜悬浮于少量等渗PBS中静置于冰箱中过夜。最后用Lowry法测定蛋白，调整膜蛋白质量浓度为500-800mg/L。
1.4.7 细胞膜的流动性测定(荧光偏振法) 1,6二苯基1,3,5己三烯 (DPH)荧光探针标记：溶于四氢呋喃(THF)，用时取一定量溶液用pH7.4的含盐的等渗PBS稀释至终浓度为0.004mmol/L，激烈震荡15min，取DPH应用液与等体积预先制备的细胞膜样品混匀，37℃温育10min。荧光测定条件：室温测定荧光强度和加偏振片以后不同光路方向的荧光，DPH使用激发波长362nm、发射波长432nm，在荧光分光光度计测定荧光，计算荧光偏振度、微黏度、各向异性和膜脂流动性。测定中主要因子Avh、Avv、Ahh、Ahv。Avv：起偏与测偏器的方向均平行于样品杯方向的荧光；Avh：起偏平行于样品杯的高度方向，测偏器的方向垂直于样品杯的高度方向荧光；Ahh：起偏与测偏器的方向均垂直于样品杯的高度方向荧光；Ahv：起偏垂直于样品杯的高度方向，测偏器的方向平行于样品杯的高度方向荧光。在描述膜流动性过程参考的数值：荧光偏振度P=(Aw-B)/(Aw+B)，B=Ahv/Ahh；微黏度η= 2P/(0.46-0.92P)；各向异性γ= 2P/(3-P)；膜脂质流动性LFU=(Pmax-Pr)-( Pr×Pr)；Pmax为0.5，Pr为所测荧光偏振度。
1.5 统计学处理 所有数据用均数±标准差(±s)表示，用SPSS10.0统计软件进行统计。组间差异比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成骨细胞观察 复苏后培养的成骨细胞贴壁生长正常，细胞形态多呈三角形、多边形、长梭形等，有粗细不均的胞浆突破，且呈集成集落样生长，无接触抑制，可相互重叠成复层生长，有伪足伸出，胞液透亮，核圆形，位于胞体一侧(图1)。
2.2 β,β胡萝卜素的提取与鉴定 有机试剂的反复提取后，通过柱层析可以得到高纯度的β,β胡萝卜素提取物，经HPLC及其光谱特征峰进行定性。从色谱图(图2)可以看出，提取物除在13.4min处出现一特征峰外没有其他峰，结合特征峰的光谱特征图(图3)推测为β,β胡萝卜素。
2.3 细胞活力 经1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L 3个浓度β,β胡萝卜素预处理，再通过1×10-5mol/L H2O2处理，细胞活力检测表明，β,β胡萝卜素组和对照组的细胞活力较模型组有显著增加(P<0.01)，且β,β胡萝卜素组处理的细胞活性随剂量升高而增强(表1)。
图1 培养48h的M3T3E1成骨细胞的形态（略）
Fig.1 M3T3E1 osteoblasts cultured for 48h (SP×400)
图2 全反式β,β胡萝卜素单体色谱图（略）
Fig.2 HPLC profile of allEisomer of β,βcarotene
图3 β,β胡萝卜素全反式单体紫外吸收光谱图（略）
Fig.3 Electronic absorption of allEisomer of β,βcarotene
表1 不同浓度β,β胡萝卜素对H2O2处理细胞活力的影响（略）
Table 1 The activity of osteoblasts in different concentrations of β,βcarotene
*P<0.05 , **P<0.01 vs. model group
2.4 ROS、LPO含量和SOD活性 1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L 3个浓度的β,β胡萝卜素预处理后，再由1×10-5mol/L H2O2处理的成骨细胞ROS、LPO含量和SOD活性检测结果表明，β,β胡萝卜素组和对照组的ROS和LPO含量较模型组显著减少(P<0.01)，而SOD活性则较模型组显著增强(P<0.01)，且呈现一定量效关系(表2)。
2.5 细胞膜的流动性 1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L 3个浓度的β,β胡萝卜素预处理后，1×10-5mol/L H2O2处理的成骨细胞膜流动性检测结果表明，β,β胡萝卜素组和对照组的流动性参数与模型组比较有显著差异(P<0.01)，且β,β胡萝卜素处理的细胞膜流动性随剂量升高而增强(表3)。
表2 不同浓度β，β胡萝卜素对细胞ROS、LPO含量和SOD活性的影响（略）
Table 2 Content of ROS, LPO and the activity of SOD in different concentrations of β,βcarotene
*P<0.05, **P<0.01 vs. model group
表3 不同浓度β,β胡萝卜素对成骨细胞膜流动性的影响（略）
Table 3 The membrane fluidity of osteoblasts in different concentrations of β,βcarotene
*P<0.05, **P<0.01 vs. model group
3 讨论
活性氧对成骨细胞具有细胞毒性作用。虽然研究表明成骨细胞表面存在类谷胱甘肽过氧化物酶作用的硒蛋白，能够保护成骨细胞免受骨改建过程中破骨细胞产生的H2O2自由基损伤，但这种抗氧化作用十分有限。活性氧的产生会导致成骨细胞的死亡，减少成骨细胞的数量。研究发现，活性氧对成骨细胞的影响可能是由于活性氧特别是OH攻击细胞增殖期的DNA及合成DNA所需的酶，使DNA发生链的断裂，并损害碱基，影响DNADNA、DNA蛋白质交联，受损的DNA转录复制功能减弱，细胞分裂繁殖发生障碍，成骨细胞产生减少，而严重的DNA损伤则导致成骨细胞过度凋亡。同时活性氧也能作为一种骨组织局部调节因子，直接或间接影响着成骨细胞产生、的各个阶段[34]。在本实验中对照组的DNA自发性损伤均较低，在H2O2作用下，DNA氧化损伤情况有所加重。这主要是由于H2O2是DNA诱导剂，它能很容易地穿透细胞膜自由进入细胞，如不被酶解可直接进入细胞核。在细胞核内，可能在结合于DNA上的金属离子如铁、铜等的催化下转变成具有高活性的或由H2O2诱发的氧化反应引起细胞内DNA储藏位点的释放，从而造成DNA链的断裂。H2O2不但可以造成DNA链的断裂，而且抑制DNA的修复。本实验结果表明，在H2O2作用下，成骨细胞SOD抗氧化酶活性降低，LPO含量和细胞体内的总ROS含量增加，导致细胞增殖活力受到抑制。相比之下，β,β胡萝卜素组对H2O2诱导的成骨细胞氧化损伤有明显的保护作用，且各项生化指标与模型组均存在明显统计学差异(P<0.01)。说明β,β胡萝卜素可以有效地降低H2O2对成骨细胞造成的损害。细胞是构成生命的基本单位，行使着多种生物学功能。细胞膜的液态镶嵌模型中脂双层可以看作具有流动性质的基质，其中镶嵌着可以活动的蛋白质。脂分子和蛋白质分子都在膜上不停地运动，构成膜的流动性。膜脂分子在膜上扩散系数较大，而蛋白质分子由于区域性限制，运动型有限，故扩散系数较小，所以一般所说的膜流动性主要是指膜脂的流动性[5]。DPH是一种刚性分子，在亲水介质中以顺式结构存在，几乎没有荧光，但它一旦进入疏水的环境中，则介质黏度变大，成为全反式结构而发出强烈的荧光。DPH分子的长轴接近与脂肪链分子长轴平行，故荧光偏振度可以较好地反映膜脂区的流动特征。荧光偏振法研究细胞膜流动性的原理是细胞膜和DPH荧光物质共同温育，荧光探针很容易插入膜脂双层中，和磷脂分子平行排列，而β,β胡萝卜素的非极性多不饱和链式分子结构易于与脂双层疏水区结合。若烃链不活动，则DPH排列整齐。用一束偏振光去激发后，能发出的荧光也将是偏振的；若烃链活动性很大，从吸收荧光到发射荧光这段时间内，DPH将随着磷脂分子的活动而有不同程度的倾斜或转动，以至发出的荧光其偏振度减小。荧光偏振度越大，说明膜脂的流动性越小；微黏度越大，膜脂流动性越小；各向异性越大，分子排列越规则，流动性越小。本实验结果表明，随着成骨细胞膜被氧化，细胞膜影泡的流动性呈现下降趋势。细胞在H2O2作用下发生的自由基损伤导致了膜的物理改变，膜流动性的下降便是一个重要指标。而β,β胡萝卜素防止成骨细胞膜脂质过氧化的实验表明，添加一定量的β,β胡萝卜素可以部分修复羟自由基引发的膜损伤。从实验数据可以发现，受到氧化损伤后表征膜的流动性的几个量均发生变化，而经不同浓度的β,β胡萝卜素处理后，这些参考量逐步得到恢复。综上所述，β,β胡萝卜素可以有效地防御和降低H2O2对成骨细胞的氧化损伤,进而通过淬灭自由基保护成骨细胞增殖，促进骨形成过程。
参考：
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