奥曲肽对人肝癌细胞株MHCC97?H的影响
【摘要】 目的 探讨奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H的影响及其机制。方法 奥曲肽体外作用于生长对数期人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H，观察生长曲线的变化；应用MTT比色分析法分析细胞的生长抑制作用；透射电镜下观察细胞形态变化。结果 奥曲肽在0.2mg/L质量浓度下体外干预MHCC97?H细胞使生长受抑；透射电镜下观察呈现凋亡形态改变；在0.05-0.8mg/L质量浓度范围内呈剂量依赖关系抑制人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H增殖(P<0.01)，并出现饱和现象。结论 奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H增殖具有抑制作用，在一定范围内呈剂量依赖关系，其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
【关键词】 原发性肝细胞肝癌；奥曲肽；增殖；凋亡
奥曲肽(Octreotide, Oct)为人工合成的生长抑素类似物，与天然的生长抑素相比，具有半衰期长、作用强大、临床应用方便的特点。近年来，Oct对肿瘤的抑制作用受到越来越多的关注。临床上应用Oct神经内分泌性肿瘤已取得了令人满意的效果，而且许多研究表明Oct也可以抑制大肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等实体肿瘤的生长转移，并认为该抑制作用与Oct诱导肿瘤细胞凋亡有关。但是，Oct抑制原发性肝癌的研究较少，本实验通过体外实验探讨Oct对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H是否存在抑制作用及可能机制，为Oct临床治疗肝癌复发转移提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株
人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H购自上海中山肿瘤研究所。
1.2 试剂和主要仪器
生长抑素类似物奥曲肽(商品名：善宁)由瑞士诺华制药有限公司惠赠；DMEM培养基购于Sigma公司，胎牛血清(FCS)购于杭州四季青公司，甲基噻唑基四唑(MTT)购于Promega公司，CO2孵育箱购于Heraeus公司。
1.3 细胞培养
人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H培养于含10%(体积分数)灭活胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内培养，2.5g/L胰蛋白酶消化，传代时间3-4d。计数细胞存活率≥95%为对数生长期细胞。
1.4 细胞生存曲线
取对数生长期细胞1×105于50mL培养瓶内，随机设10组，每组复设3瓶，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内培养24h。更换培养基，随机取5组细胞培养瓶内加入奥曲肽至终质量浓度为0.2mg/L，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下CO2孵育箱内继续培养，分别于1-5d各计数一次干预组及阴性对照组的细胞数，取细胞计数平均值，以奥曲肽作用时间为横坐标，细胞计数为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.5 MTT比色分析法
取对数生长期细胞，培养液配成3×105/mL单细胞悬液，每孔200μL接种于96孔板中，随机分为7组，每组复设6孔；另复设6孔加入培养基200μL为调零组。37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下培养24h。除调零组外，每组分别加入生理盐水稀释奥曲肽，使各组奥曲肽终质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/L，阴性对照组加入等体积生理盐水，轻微吹打，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下培养36h。各孔加5g/L甲基噻唑基四唑(MTT)20μL，培养4h至出现蓝色结晶物。吸弃孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，震荡10min。490nm波长下酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A)，各浓度下奥曲肽对MHCC97?H细胞的抑制率。抑制率=(1-加奥曲肽组平均吸光度值/加无菌生理盐水组平均吸光度值)×100%
1.6 透射电镜扫描
37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度下，对数生长期细胞3×105于50mL细胞培养瓶内培养24h，阳性干预组加入奥曲肽至终质量浓度为0.2mg/L；阴性对照组加入等体积生理盐水，继续培养48h。胰蛋白酶消化细胞，置于EP管中，离心2000×g，10min，弃上清，加入4℃预冷的2.5%(体积分数)戊二醛固定2h，PBS清洗，再用1%(10g/L)锇酸固定30min，PBS洗，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和枸橼酸铅双染色，透射显微镜下观察并摄影。
1.7 统计学处理
实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，细胞抑制率与奥曲肽质量浓度间关系检验采用相关分析。SPSS10.0统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 Oct对肝癌细胞生长曲线的影响
处于对数生长期的人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H 在未给予奥曲肽干预时，细胞分裂增殖旺盛；给予奥曲肽干预(0.2mg/L)时，细胞分裂增殖在干预后第3天开始出现明显减缓，第5天甚至出现“负增长”，提示在0.2mg/L质量浓度时，奥曲肽不仅抑制MHCC97?H细胞的增殖，而且有细胞死亡出现(图1)。
2.2 奥曲肽对肝癌细胞抑制率的影响
细胞毒性实验可见随奥曲肽质量浓度在0.05-0.8mg/L范围增加时，细胞抑制率逐步由10.97%提升至45.16%，细胞抑制率与奥曲肽质量浓度明显相关(r=0.86，P<0.01)；同时当奥曲肽质量浓度在0.05-0.4mg/L范围时，细胞抑制率随奥曲肽质量浓度的增加快速提升，而质量浓度在0.4-0.8mg/L范围内时，细胞抑制率随奥曲肽质量浓度增加的趋势明显减缓；相邻的奥曲肽质量浓度下细胞抑制率两两对比可见当奥曲肽质量浓度在0.05-0.4mg/L范围内时，相邻组间差异具有统计学意义(P<0.05)，而在0.4-0.8mg/L范围内时，相邻组间差异不具有统计学意义(P<0.05，表1)，出现饱和现象。表1 不同浓度奥曲肽作用MHCC97?H细胞的抑制率（略）
2.3 奥曲肽对肝癌细胞超微结构的影响
透射电镜扫描可见奥曲肽干预组肿瘤细胞膜性结构完整，未见胞浆成分外溢，胞浆内出现“空泡化”现象(图2)；部分肿瘤细胞核膜皱缩，胞核内染色质浓集，核膜下边缘化，密度提高，呈新月型改变，电镜下呈凋亡细胞改变(图3)。提示奥曲肽在0.2mg/L质量浓度时，既影响MHCC97?H细胞的活性，又可诱导部分肿瘤细胞发生凋亡。
3 讨 论
我国是原发性肝癌高发区，发病数和死亡数均呈逐年增高趋势。近20年来，我国肝癌患者的死亡率增加了41.17%，突出的问题是原发性肝癌的远期疗效并不理想，癌肿的局部扩散和转移是肝细胞肝癌致死的主要原因之一，也是肝癌中的难点。人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H由上海中山肿瘤研究所于肝癌患者肿瘤组织内取得，体外连续培养筛选而建立的人肝癌细胞株。报道[1?2]于裸鼠肝内种植MHCC97?H细胞株建立肝癌模型，饲养35d后，裸鼠肝癌肺转移率高达100%，而且MHCC97?H细胞株体外连续培养传代120余代，生物性状保持稳定，是研究肝癌复发转移的良好模型。生长抑素(somatostatin, SS)是一种环状多肽类激素。1972年首次在下丘脑提取物中被发现，其广泛存在于人体的内分泌及外分泌系统中，并能阻断胰岛素、胰高血糖素及胰淀粉酶的分泌,抑制胃酸分泌,调节心血管活性，参与大脑的感觉形成及感觉相关的活动行为的调控[3]。 随后，临床上发现SS不仅能抑制绝大多数具有神经内分泌功能的肿瘤的增殖，对普通的实体性肿瘤亦存在抑制作用，如胃癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌等[4?6]。人工合成的生长抑素类似物有：奥曲肽(octreotide)，伐普肽(vapreotide)，兰瑞肽(lanreotide)及司格列肽(seglitide)等。本实验以人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H为研究对象，发现Oct在0.2mg/L水平时对其增殖具有延缓作用；随奥曲肽作用时间的延长，肿瘤细胞出现“负增长”现象。提示奥曲肽在0.2mg/L时不但可以抑制人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H的增殖，而且随作用时间延长可杀伤肿瘤细胞。同时，发现奥曲肽在0.05-0.8mg/L范围时，奥曲肽抑制肿瘤作用随其剂量的加大而加强，细胞抑制率与奥曲肽质量浓度明显相关(r=0.86，P<0.01)，表现为剂量依赖关系。SS抗肿瘤作用机制到目前为止发现有：①通过与特异性的SS受体(somatostatin receptor, SSTR)结合，直接发挥抑制增殖作用；②通过抑制促肿瘤生长的激素及细胞因子而发挥间接抑制作用[7]。Rabinowitz 等[8]利用111In 标记的奥曲肽证实肝癌细胞存在SSTR表达。本实验虽未检测MHCC97?H细胞株是否存在SSTR，但是发现奥曲肽在0.05-0.8mg/L范围时对MHCC97?H细胞抑制率存在剂量依赖关系。但是，这种剂量依赖关系的强度随奥曲肽浓度的加大而趋于弱化，呈现饱和现象。提示奥曲肽可能通过存在于MHCC97?H细胞的相应受体发挥肿瘤抑制作用，而当奥曲肽达到一定剂量时，MHCC97?H细胞的SSTR与Oct结合消耗殆尽，奥曲肽对肿瘤细胞的抑制作用趋于饱和[8]。透射电镜扫描发现Oct作用于MHCC97?H 48h后，肿瘤细胞胞浆内出现“空泡化”现象，同时发现2期凋亡细胞，而没有发现坏死细胞。提示Oct在影响肿瘤细胞活力的同时，可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，但是并不发挥细胞毒作用，与细胞生长曲线及MTT比色分析结论一致。提示诱导细胞凋亡是Oct抑制人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97?H增殖的机制之一。研究表明SS可与其相应受体SSTR2及SSTR5结合，通过提高胞内Ca2+浓度，使原来折叠得很紧的染色质变得松散,暴露出水解部位，使得DNA易于被降解，同时部分研究表明SS可以诱导肿瘤细胞野生型p53基因表达[9]或c?Met表达[10]，诱导凋亡。本实验对奥曲肽诱导MHCC97?H细胞凋亡的内在机制未进行探讨，有待进一步研究。
【文献】
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