依曲替酸对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响
作者：罗素菊，彭振辉，郑焱，张路坤，王蔚，王国荣
【摘要】 目的 研究依曲替酸对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB?EGF)mRNA表达的影响。方法 0.1和1μmol/L伊曲替酸处理正常人KC 12h后，用噻唑蓝比色法(MTT法)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)法分别检测KC增殖和HB?EGF mRNA表达的改变。结果 依曲替酸处理12h后，可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HB?EGF mRNA的表达。0.1和1μmol/L伊曲替酸分别使KC增殖抑制10.2%和14.4%，使HB?EGF mRNA增加到正常对照组的3.2和7.1倍。与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 依曲替酸可剂量依赖上调HB?EGF mRNA的表达，其可能参与依曲替酸对KC增殖的抑制作用。
【关键词】 表皮生长因子；角质形成细胞；维甲酸
Effect of acitretin in inducing the expression of heparin?binding epidermal?growth?factor?like growth factor mRNA in normal human keratinocytes
ABSTRACT: Objective To investigate the alteration of cell proliferation and heparin?binding epidermal?growth?factor?like growth factor(HB?EGF)mRNA expression in cultured normal human keratinocytes after acitretin treatment. Methods After a 12?hour incubation with 0.1 and 1μmol/L acitretin in normal human keratinocytes, the proliferation potency of the cells was detected by MTT colorimetric assay and the expression of HB?EGF mRNA was examined by real?time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR). Results Both keratinocytes growth inhibition and HB?EGF mRNA expression was dose?dependently induced by acitretin. Treatment with 0.1 and 1μmol/L acitretin inhibited keratinocyte proliferation by 10.2% and 14.4%, and elevated HB?EGF mRNA by 3.2?and 7.1?fold, respectively. Conclusion Upregulated HB?EGF mRNA expression induced by acitretin in normal human keratinocytes may be involved in regulating keratinocyte growth inhibition after acitretin treatment.
KEY WORDS: epidermal growth factor; keratinocyte; retinoid
维甲酸(retinoic acid, RA)是维生素A的代谢物或衍生物，具有广泛的生物学功能，包括参与调控细胞的增殖、分化和凋亡，抑制黑色素生成，抑制皮脂分泌，调节免疫功能，抗衰老等。自人工合成全反式RA后，RA已被广泛应用于多种皮肤科疾病的，如角化性皮肤病、痤疮、银屑病、皮肤光老化等，并且取得了良好的疗效。通常认为RA通过两类受体发挥作用，即维甲酸受体(retinoic acid receptors, RAR)和维甲酸X受体(retinoid X receptors, RXR)，但其具体作用机制至今尚不完全清楚。体外角质形成细胞(keratinocyte, KC)培养、皮肤器官培养、皮肤活检及动物实验研究表明RA可诱导HB?EGF的表达，提示RA可能部分通过调节HB?EGF的表达，从而发挥其生物学功能[1]。肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparin?binding epidermal?growth?factor?like growth factor, HB?EGF)与转化生长因子?α、双向调节因子和表皮调节素等生长因子相互作用，通过旁分泌形式调节KC的增殖和分化。HB?EGF先以跨膜形式合成(proHB?EGF)，其外功能区脱落后形成游离形式(sHB?EGF)的HB?EGF。proHB?EGF可抑制细胞的生长，而sHB?EGF是KC、纤维母细胞、平滑肌细胞等多种细胞的有丝分裂原[2]。在表皮增生性皮肤病如银屑病、基底细胞癌、鳞状细胞癌中，HB?EGF的表达升高[3]，RA处理后可逆转银屑病皮损中HB?EGF的异常表达[4]，提示HB?EGF在RA对KC生长和分化的调节中发挥重要的作用。因此，我们在体外用不同浓度的依曲替酸刺激培养的正常人KC，检测其对细胞增殖和HB?EGF mRNA表达的影响。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 KC无血清培养基(KC?SFM)、低糖DMEM、Dispase酶均购于Gibco公司，依曲替酸为重庆华邦制药股份有限公司惠赠，TRIzol试剂购于Invitrogen公司，RT?PCR试剂盒购于Fermentas公司，SYBR green 2×PCR混合液购于ABI公司，PCR配套试剂购于TaKaRa公司，GeneAmp 9700 PCR仪和PRISM 7900 PCR仪均为ABI公司产品。
1.2 原代KC的培养 取健康人环切术后包皮，消毒液浸泡后，置于2.5g/L Dispase酶4℃消化过夜。次日分离表、真皮，将表皮置于2.5g/L胰酶与0.2g/L EDTA(1∶1)混合液中，消化10min，用含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打后，100目筛网过滤，离心收集细胞，加入KC?SFM，接种入培养瓶，于37℃、50mL/L CO2条件下培养，次日更换新培养基，以后每3d换液一次，取3-5代细胞进行实验[5]。将实验细胞传代入6孔培养板中，当细胞90%融合时，进行干预处理，继续培养12h。每组设3个孔，并设置未处理的正常对照组。
1.3 MTT法检测细胞的增殖 将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，加入含0.1或1μmol/L依曲替酸的培养液，继续培养12h。设空白对照组(只加细胞培养液，无细胞)。吸出培养液，每孔中加入MTT(5mg/mL)后再孵育4h，弃上清液后每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min。以空白对照组为基准，在490nm波长处检测吸光度值。生长抑制率(%)=1-A490nm(实验组细胞)/A490nm(对照组细胞)×100%。
1.4 总RNA的提取和cDNA的合成 按10cm2(培养瓶面积)加入1mL TRIzoL提取总RNA，操作严按试剂盒说明进行。用12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，用紫外分光光度计测RNA含量和纯度。cDNA的合成操作严格按试剂盒说明进行。
1.5 实时荧光定量RT?PCR检测HB?EGF mRNA的表达 用10倍比稀释β?actin基因的PCR扩增产物做相对定量的标准品。实时定量PCR反应体系为25μL，包括：模板cDNA 2μL，SYBR Green 2×PCR混合液12.5μL，H2O 8.5μL，上游和下游引物(β?actin或HB?EGF)各1μL。扩增条件为：50℃ 2min，95℃ 10min，然后95℃ 30s，60℃ 1min，循环40次。HB?EGF上游引物序列：GGCTCCCTCCTGCATCTG，下游引物序列：AGGATGGTTGTGTGGTCATAGGT，产物105bp；β?actin上游引物序列：CAGCACAATGAAGATCAAGATCA，下游引物序列：CGTCATACTCCTGCTTGCTGA，产物125bp。在PCR过程中设立无模板阴性对照。在实验结束后进行溶解曲线分析，以鉴定产物是否单一。
1.6 统计学处理 用2-△△Ct法处理实时荧光定量RT?PCR数据，所得结果即表示目的基因相对于正常对照组所改变的倍数[6]。统计学分析采用SPSS11.5软件进行Dunnett?t检验，数据用±s表示，P<0.05则认为有统计学意义。
2 结果
2.1 依曲替酸对KC增殖的影响 依曲替酸可剂量依赖抑制KC的生长，0.1和1μmoL/L伊曲替酸分别使KC的生长抑制10.2%和14.4%(表1)。
表1 依曲替酸对KC增殖的影响（略）
Table 1 Effects of acitretin on the proliferation of keratinocytes
**P<0.01 vs. control
2.2 总RNA纯度及质量鉴定 经测定A260/280比值在1.7-1.9之间，表明RNA无污染，电泳显示5s、18s和28s三条带，说明RNA完整性较好。
2.3 实时荧光定量RT?PCR检测依曲替酸对HB?EGF mRNA的影响 标准品的扩增曲线见图1。待测标本的Ct值均在标准曲线内，说明所测值可信。溶解曲线分析无明显非特异峰形成，说明无明显非特异性扩增。依曲替酸可剂量依赖诱导HB?EGF mRNA的表达，0.1和1μmoL/L处理后分别使HB?EGF mRNA增加到正常对照组的3.2和7.1倍(图2)。
图1 标准品的扩增曲线（略）
Fig.1 Amplification curve of standard sample
图2 依曲替酸对HB?EGF mRNA的影响（略）
Fig.2 The expression of HB?EGF mRNA was elevated by 3.2? and 7.1? fold after treatment with 0.1 and 1μmoL/L acitretin *P<0.05 vs. control
3 讨论
依曲替酸处理后，可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HB?EGF mRNA的表达。以往的研究表明RA对细胞的生长有双重调控作用，在其浓度低于0.1μmoL/L时可刺激KC的增殖，而高于此浓度时则抑制KC的增殖[7]。但是，在此实验中我们观察到0.1μmoL/L依曲替酸已明显抑制KC的增殖，可能是在实验中所用的RA药物不同所致。HB?EGF是RA受体所调控的主要靶基因，其与其他细胞因子相互作用调节KC的增殖和分化。HB?EGF与EGF受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)和ErbB4结合，诱导EGFR磷酸化，并启动细胞活化信号，调节细胞的生长，使细胞维持于稳定的增殖分化状态。proHB?EGF在基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease, MMP)和解聚素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease, ADAM)的介导下，外功能区脱落，形成sHB?EGF[8]。体外研究表明，proHB?EGF有抑制生长的活性，而sHB?EGF有刺激生长的作用[2]。RA可下调MMP如MMP7的表达[9]。因此，我们假设，当proHB?EGF表达轻度增加时，可在MMP 和ADAM的充分作用下转化生成更多的sHB?EGF，从而刺激邻近细胞的生长，而当proHB?EGF的表达明显高于上述水平时，其未能充分转化为sHB?EGF，而使增多的proHB?EGF与EGFR结合后通过旁分泌作用抑制邻近细胞的生长。生长因子对细胞生长有双重调节作用，其既可通过激活丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)和磷脂酰肌醇3?激酶(phosphatidylinositol 3?kinase, PI?3K)通路促进细胞生长，又可通过信号转导和转录活化蛋白(signal transducers and activators of transcription, STAT)诱导的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p21waf1和caspase 1而导致细胞生长停滞或死亡[10]。正常情况下，STAT诱导的p21waf1和MAPK活性处于平衡状态，而维持细胞的正常生长[11]。当这两种信号途径的平衡状态被破坏时，细胞发生过度生长或凋亡。HB?EGF与EGFR结合后可同时激活生存信号途径和凋亡信号途径[12?13]。因此，我们假设，HB?EGF表达轻度增高时，被激活的生存信号强于死亡信号，而刺激KC的生长；当HB?EGF高水平表达时，激活的死亡信号强于生存信号，而抑制KC的生长，诱导其凋亡。总之，HB?EGF通过旁分泌与EGFR结合，使EGFR活化，随后激活不同的信号途径，而刺激或抑制KC的生长。总之，依曲替酸可剂量依赖上调HB?EGF mRNA的表达，其可能参与调节依曲替酸对KC增殖的抑制作用。这对依曲替酸表皮增生性皮肤病的机制有一定的提示作用。关于RA调节KC增殖的分子机制还需进一步研究。
基金项目：国家基金资助项目(No.30371295,30400387)；陕西省自然科学基金资助项目(No.2004C211)
【】
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