治带片中苦参碱及氧化苦参碱的HPLC法测定
【摘要】 目的 建立治带片中苦参碱及氧化苦参碱的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法 色谱柱：Lichrospher?NH2(4.6mm×250mm，5μm)，C18保护柱；流动相：乙腈?无水乙醇?0.5mol/L磷酸水溶液(80∶10∶10)；检测波长212nm；流速1.0mL/min；柱温：室温；进样量20μL。结果 苦参碱和氧化苦参碱线性范围均为1.0-10.0μg/mL，回归方程苦参碱为：C=1.201×10-4A+0.161，r=0.9992；氧化苦参碱为：C=1.366×10-4A+0.221，r=0.9996，平均回收率分别为99.9%和99.4%，RSD分别为1.48%和4.33%。结论 本法简便快捷，结果准确，可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 治带片；苦参碱；氧化苦参碱；高效液相色谱
Determination of Alkaloids in Zhidaipian Tablets by high performance liquid chromatogram
ABSTRACT: Objective To establish a method of high performance liquid chromatogram (HPLC) for measuring matrine and oxymatrine in Zhidaipian Tablets. Methods A Lichrospher?NH2 column(4.6mm×250mm, 5μm) was used with a mobile phase consisting of acetonitrile?ethanol?0.5mol/L phosphoric acid (80∶10∶10), and in a flow rate of 1.0mL/min. The detective wavelength was 212nm. Column temperature was room temperature and the injection quantity was 20μL. Results The samples were well separated. The linear range was the same for the target (1.0-10.0μg/mL). The linear equations for matrine was C=1.201×10-4A +0.161, the correlation coefficient was 0.9992, and for oxymatrine was C=1.366×10-4A +0.221, while the correlation coefficient was 0.9996, respectively. The mean recovery rate were 99.9% and 99.4%, respectively. RSD was 1.48% and 4.33%, respectively (n=6). Conclusion The method is simple, reliable, accurate and can be used to the quality control of the Zhidaipian Tablets.
KEY WORDS: Zhidaipian tablets; matrine; oxymatrine; high performance liquid chromatogram
治带片处方由墓头回、苦参、金樱子、知母(盐炒)、苍术(炒)等组成。清利湿热，止带。用于湿热下注，赤带，白带，黄带等症。方中苦参为君药，其有效成分是苦参碱和氧化苦参碱。为有效控制药品质量, 对制剂中的苦参碱和氧化苦参碱采用高效液相色谱(HPLC)法进行含量测定。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药 日本岛津LC?10AT高效液相色谱输液泵，SPD?10AVP紫外可见检测器，岛津7725i进样器，ANASTAR色谱工作站，DL?360超声波清洗器(浙江象山县石浦海天仪器厂，功率240W，频率35kHz)，乙腈、无水乙醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。苦参碱和氧化苦参碱对照品由药品生物制品检定所提供(编号分别为110805?200306和0780?200004)，供含量测定用。治带片由西安阿房宫制药有限公司提供(批号20030611-20030613)。
1.2 对照品溶液的配制 精密称取苦参碱、氧化苦参碱对照品适量，用乙腈?无水乙醇(8∶1)溶解，分别制成0.20mg/mL溶液作为苦参碱、氧化苦参碱对照品储备液。
1.3 供试品溶液的制备 取治带片2片，研细，称0.25g，于100mL磨口锥形瓶中，加入20mL氯仿及 0.5mL浓氨液，密塞，称定重量。超声处理30min，放冷，用氯仿补足失去的重量，摇匀、过滤，取续滤液5mL，通过中性氧化铝柱(100-200目5g，装前于高温电炉400℃处理2h，冷却后装于内径1cm层析柱中)。依次用氯仿、氯仿?甲醇(7∶3)各20mL洗脱，合并洗脱液，挥去并赶尽溶剂，残渣用乙腈?无水乙醇(8∶1)溶解并定容至10.0mL，测定时再用乙腈?无水乙醇(8∶1)稀释5倍并过0.45μm微孔滤膜，取续滤液测定。
1.4 阴性对照溶液的制备 依处方工艺制成不含苦参药材的片剂，再按1.3方法制成阴性对照溶液。
2 结果
2.1 色谱条件 色谱柱Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，C18保护柱(部件号：011200002)；流动相为乙腈?无水乙醇?0.5mol/L磷酸水溶液(80∶10∶10)，使用前经0.45μm微孔滤膜过滤并脱气；检测波长212nm；流速1.0mL/min；柱温：室温；进样量20μL。在此条件下，对照品、供试品及阴性对照溶液的色谱图如图1所示。
图1 治带片HPLC色谱图(横坐标为时间：min)（略）
Fig.1 HPLC graphs of matrine and oxymatrine in Zhidaipian Tablets
a: Standard; b: Sample; c: Blank; 1: Matrine; 2: Oxymatrine
2.2 线性关系考察 用乙腈?无水乙醇(8∶1)稀释为分别含10μg/mL的苦参碱和氧化苦参碱的对照品溶液，制成含1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL苦参碱和氧化苦参碱的对照品溶液，进样，测定。以峰面积A对对照品溶液的浓度C作曲线，进行线性回归，回归方程苦参碱为：C=1.201×10-4A +0.161，r=0.9992；氧化苦参碱为：C=1.366×10-4A +0.221，r=0.9996。说明苦参碱和氧化苦参碱质量浓度在1.0-10.0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.3 供试品溶液制备方法的考察 实验采用正交法对氯仿体积、超声时间、氧化铝重量等影响因素进行了考察。
2.3.1 因素水平 A氯仿体积(mL)：A1=10，A2=20，A3=30。B超声时间(min)：B1=15，B2=30，B3=45。C氧化铝重量(g)：C1=3，C2=4，C3=5。
2.3.2 实验方法及结果 精密称取研细的同批号相同重量供试品于100mL磨口锥形瓶中，分别按L9(34)正交表(表1)进行试验，测定苦参碱峰面积(P.A. of matrine)和氧化苦参碱峰面积(P.A. of oxymatrine)，用统计软件SPSS11.0进行分析处理，结果见表2-4。
2.3.3 供试品溶液制备条件的优化 上述实验结果表明，对苦参碱而言，因素A、C对实验结果均无显著性影响(P>0.05)，B对结果有显著性影响(P<0.05)，B1与B2、B3间有显著性差异(P<0.05)，B2、B3间无显著性差异(P>0.05)；对氧化苦参碱而言，因素A、B、C对实验结果均无显著性影响(P>0.05)。考虑到实验操作便易等因素，供试品溶液最佳提取工艺为A2B2C3。
表1 苦参碱和氧化苦参碱提取方法正交试验L9(34)表（略）
Table 1 The results of orthogonal test for extraction technology of matrine and oxymatrine
表2 苦参碱提取方法多因素方差分析（略）
Table 2 Tests of between?subjects effects for extraction technology of matrine
表3 苦参碱不同超声时间提取的方差分析表（略）
Table 3 Multiple comparisons of different ultrasonic extracting times of matrine
表4 氧化苦参碱提取方法多因素方差分析（略）
Table 4 Tests of between?subjects effects for extraction technology of oxymatrine
2.4 精密度试验 按1.3方法制备一份样品，重复进样5次，每次20μL，按2.1色谱条件测定峰面积，结果苦参碱、氧化苦参碱峰面积积分值的RSD分别为1.18%和1.03%。
2.5 稳定性试验 按1.3方法制备一份样品，分别于0、2、4、6、8h精密吸取20μL，按2.1色谱条件测定，记录峰面积积分值，结果苦参碱、氧化苦参碱峰面积积分值的RSD分别为4.32%和2.39%，表明供试品溶液在8h内稳定。
2.6 重复性试验 取同批样品5份，按1.3方法制备供试品并按2.1色谱条件测定，结果苦参碱、氧化苦参碱质量分数的RSD分别为1.48%、2.16%。
2.7 回收率试验 采用加标回收法。取已知含量的同批样品数片，研钵中研细，称重6份，分别精密加入苦参碱和氧化苦参碱对照品，按1.3方法制备样品并按2.1色谱条件测定。结果苦参碱和氧化苦参碱的平均回收率分别为99.9%和99.4%，RSD分别为1.48%和4.33%(表5)，表明回收率良好。
表5 治带片中苦参碱和氧化苦参碱回收率试验结果（略）
Table 5 Results of recovery test for matrine and oxymatrine in Zhidaipian tablets
2.8 样品测定 按1.3方法及2.1方法分别测定不同生产批号的三批样品，结果三批样品含苦参碱和氧化苦参碱总量在0.596-1.205mg/g之间。按每片0.25g计，每片含苦参碱和氧化苦参碱总量在0.149-0.301mg之间。
3 讨论
苦参中苦参碱的含量测定药典以薄层扫描法测定[1]。本文参照[2?5]，在碱性条件下，用氯仿提取苦参碱后，过中性氧化铝柱以消除其他干扰成分，并比较了不同氧化铝的处理方法对消除干扰成分的效果，试验证明，氧化铝在400℃高温电炉里处理2h后，效果更好。应用HPLC，以Lichrospher?NH2柱(4.6mm×250mm)为固定相，乙腈?无水乙醇?磷酸水溶液为流动相，同时测定苦参碱和氧化苦参碱含量。通过正交L9(34)试验对氯仿体积、超声时间、氧化铝重量等影响苦参碱和氧化苦参碱提取的因素进行了考察，为测定治带片中苦参碱和氧化苦参碱的含量提供了一个可靠的方法。
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