白血病患者血清VEGF和sFas水平及其相关性研究

【关键词】  ,,白血病;血管内皮细胞生长因子;可溶性Fas;多药耐药

    ［摘要］  目的  观察白血病患者血清VEGF和sFas水平及二者的相关性。方法  采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对25例白血病患者血清VEGF和sFas水平进行同步检测，并比较其水平变化的相关性。其中VEGF水平以VEGF/PLT的较正值表示。结果  复发/未缓解组VEGF和sFas水平明显高于正常对照组和缓解组，差异有统计学意义。缓解组和对照组之间差异无显著性。VEGF与sFas之间可见显著正相关关系且二者与乳酸脱氢酶(LDH)亦有一定相关性。结论  血清VEGF和sFas水平的测定可用于评价白血病的病理状态及转归，联合检测这些因子可能更有临床价值。

    ［关键词］  白血病;血管内皮细胞生长因子;可溶性Fas;多药耐药

     ［Abstract］  Objective  To study the serum levels of VEGF and sFas and their correlation in patients with leukemia.Methods  The levels of VEGF and sFas were simultaneously detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)in 25 patients with leukemia.The level of VEGF was corrected by platelet count. Results  VEGF and sFas concentrations of the refractory/relapsed group were significantly higher than that of the control group and the remission group (P<0.05),but no significant difference was found between the remission group and the control group(P>0.05).Statistical correlation was observed between the level of VEGF and sFas in patients with leukemia (P<0.05).VEGF and sFas also have some relationship with LDH.Conclusion  The serum levels of sFas and VEGF can be utilized for monitoring the development of leukemia and predicting its prognosis,combined measuring of these parameters might be much more implication.

    ［Key words］  leukemia;VEGF;sFas;MDR

    血管内皮细胞生长因子(VEGF)与血液系统恶性肿瘤关系密切。它不仅以旁分泌方式作用于血管内皮细胞促进血管新生，还以自分泌方式作用于肿瘤细胞表面的VEGF受体，促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡，并增强其对化疗药物的抵抗作用引起细胞耐药。Fas/FasL是介导细胞凋亡的一对重要膜蛋白分子，在肿瘤细胞凋亡中起重要作用。sFas是缺乏跨膜区的可溶性Fas分子，可与膜Fas竞争性结合FasL，阻断由Fas介导的细胞凋亡。白血病细胞多药耐药(MDR)是白血病化疗失败的主要原因之一，凋亡调控障碍与MDR的发生密切相关［1］。越来越多的研究表明：VEGF、sFas与白血病的发生密切相关，但目前国内外对二者联合检测的研究较少。因此，观察VEGF、sFas在白血病中的表达、对白血病疗效的影响及二者的相关性有助于进一步了解白血病发病机制及MDR机制。本实验用ELISA法同步测定了白血病患者血清VEGF和sFas水平，并分析二者的相关性。

    １  对象与方法

    1.1  观察对象  25例血清标本来自于2006年4～10月在首都医科大学附属北京同仁血液科住院的白血病患者，均经临床表现、细胞形态学、细胞组化染色等确诊。男12例，女13例，年龄14～81岁，中位年龄38岁。其中初发11例(M2 6例，M4 1例，AMLL 1例，ALL 1例，CLL 2例)，未缓解/复发8例(M2 5例，M4 2例，ALL 1例)，完全缓解/部分缓解6例(M2 4例，M3 2例)。正常对照组：12例健康体检合格者，男7例，女5例，年龄24～68岁，中位年龄26岁。   

    1.2  标本采集  取研究对象清晨、空腹、不抗凝静脉血5ml，2 h内以2000 r/min，20 min离心，得血清标本，每份标本分装，-20℃冻存，避免反复冻融。

    1.3  血清VEGF、sFas水平测定  采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清VEGF及sFas水平，试剂盒分别购自武汉博士德生物工程有限公司和尚柏生物技术有限公司，操作步骤按说明书进行。ELX-800酶标仪购自BIO-TEK公司；MuLtiskanMK3酶标仪购自美国Thermo公司。为平衡血小板数差异造成的系统误差，将每份样本VEGF测定值(pg/ml)以其血小板计数(109/L)进行标化，最终以标化值VEGF/PLT(pg/106)作为研究指标。

    1.4  统计学方法  数据以均数±标准差(x±s)表示，用F方差分析进行组间比较。变量间的关系采用相关系数的显著性检验。用 SPSS 11.5软件包进行统计分析。

    2  结果

    2.1  VEGF、sFas在白血病的表达  见表1。

    2.1.1  VEGF/PLT  复发/未缓解组明显高于初发组、缓解组和对照组，差异均有非常显著性(P<0.01)。初发组、缓解组及对照组之间差异无显著性(P>0.05)。

    2.1.2   sFas  复发/未缓解组高于初发组、缓解组和对照组，其中与缓解组及对照组之间差异有非常显著性(P<0.01)，而与初发组之间差异无显著性(P>0.05)。初发组亦高于缓解组和对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。 表1  各组研究对象血清VEGF/PLT、sFas水平的测定  (略)注：与正常对照组比较，ΔP<0.01;与缓解组比较，*P<0.01

    2.2  sFas、VEGF与LDH之间的关系  以25例白血病患者LDH中位值(234 u/L)为界将其分为两组: A组(LDH≤234 u/L)和B组(LDH>234 u/L)，分别比较两组中sFas和VEGF水平。结果发现，A组sFas 和VEGF/PLT值均明显低于B组，差异有统计学意义(P1<0.01，P2<0.05)。见表2。表2  sFas、VEGF/PLT与LDH之间的关系  (略) 注：P1: A组与B组sFas比较；P2：A组与B组VEGF/PLT比较

    2.3  血清VEGF/PLT与sFas的相关性  25例白血病患者血清VEGF/PLT与sFas水平呈显著正相关关系(r=0.416，P<0.05)。

    3  讨论

    白血病多药耐药是其的主要障碍，虽然近年来新的化疗药物和化疗方案不断出现，但多数患者仍因细胞耐药导致化疗失败。耐药主要是因为白血病细胞抵抗化疗药物诱导的细胞凋亡。

    血管内皮细胞生长因子(VEGF)是目前所知最强的正性血管生成调节因子，与血液系统恶性肿瘤的关系日益受到重视，它不仅参与白血病的发生而且与肿瘤细胞耐药有关。由于VEGF在血小板中有一定程度的表达，在凝血过程中血小板可以释放VEGF至血清中，故血小板数目能显著影响血清VEGF水平［2］。而绝大部分急性白血病患者外周血中血小板水平很低，故必须考虑因血小板数过低导致凝血过程中血小板释放的VEGF减少对血清总VEGF水平的干扰。国外研究者的方法［3］，本实验将血清VEGF浓度除以外周血小板计数作为标化值反映白血病患者血清VEGF的实际水平。结果发现复发/未缓解组血清VEGF水平明显高于缓解组及正常对照组，而缓解组较对照组之间差异无显著性。值得注意的是，难治复发性白血病血清VEGF水平明显高于初发非难治性白血病，提示VEGF可能与肿瘤细胞耐药有关。Katoh等［4］在CMK86细胞系中加VEGF和化疗药物共孵育，结果发现用VEGF处理过的CMK86细胞凋亡分数只是未作VEGF处理的对照组的70%～80%，表明VEGF可以抑制化疗药物诱导的CMK86细胞凋亡。徐丹等［5］将VEGF165 cDNA转染入HL-60细胞，发现转染后的HL-60细胞增殖和集落形成的活力明显增加。另有报道：VEGF具有抵抗VP-16、阿霉素等药物杀伤白细胞的作用，推测其可能具有广谱对抗化疗药物诱导白血病细胞凋亡的作用。这些研究提示抑制VEGF可以提高白血病细胞对化疗药物的敏感性，具有一定的临床意义。

    关于VEGF抗凋亡的作用机制仍在进一步研究中，目前认为：VEGF高表达与某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活和某些细胞因子的改变有关［6］。有研究发现VEGF可通过诱导抗凋亡基因MCL1的高表达进而抑制caspase3酶的活性而抵抗化疗药物诱导细胞凋亡的作用，导致MDR的发生［7］。深入研究VEGF促白血病细胞增殖及抗凋亡的机制以及与其他抗凋亡因子之间的关系，对于设计新的难治性白血病的治疗方案具有重要意义。

    Fas是一种跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族。当Fas与其配体或抗Fas结合时可向靶细胞内传递死亡信号，引起Caspase酶原激活，导致敏感Fas阳性细胞凋亡［7］。Fas基因转录异常时可产生缺乏跨膜区的Fas蛋白，从细胞膜脱落形成可溶性Fas分子(sFas),它与膜Fas竞争性结合FasL，从而阻断由Fas介导的细胞凋亡。本研究发现：难治/未缓解组血清sFas水平较正常对照组明显升高，经联合化疗后处于缓解期的患者血清sFas水平较未缓解组明显降低，而与正常对照组差异无显著性。这与国内外多数文献报道结果一致。表明sFas作为凋亡抑制因子在白血病细胞MDR中起重要作用，sFas持续明显升高，细胞凋亡机制启动不利，对化疗不敏感，引起细胞耐药。

    由此可见,VEGF,sFas与白血病的MDR均有不同程度的相关性，但关于二者具体联系的研究较少，本实验发现，白血病患者VEGF与sFas的表达成显著正相关，提示二者在抗凋亡机制方面可能存在某种相关关系，但其相关机制还不是很清楚，有待在以后的研究中进一步探讨。另外，对于白血病的预后判断，同时检测这两项指标较单独检测更有价值。

    乳酸脱氢酶(LDH)是反映肿瘤负荷的一个指标，LDH升高提示预后不良。我们在试验中以LDH中位值为界将白血病患者分为两组，发现LDH在中位值以上组的患者sFas和VEGF水平明显高于中位值以下组患者的水平，推测sFas和VEGF与白血病肿瘤负荷有关，可以作为监测病情，判断预后的参考指标，对白血病的诊断及疗效判定有一定意义。

    本研究结果有助于对肿瘤细胞耐药机制的了解，并为利用诱导细胞凋亡来逆转肿瘤细胞耐药做了一定的临床研究，但由于体内环境非常复杂，是否可以通过在体内诱导凋亡而用于肿瘤MDR的逆转及治疗，尚需做更多的研究。

    ［参考文献］

    1  杨纯正,王树滨.肿瘤化疗和细胞凋亡.中华血液学杂志,2000,21:285-286.

    2  Verheul HM,Hoekman K,Luykx-de Bakker S,et al.Platelet: Transporter of vascular endothelial cell growth factor.Clin Cancer Res,1997,3(12 Pt 1): 2187-2190.

    3  Adams J,Carder PJ,Downey S,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)in breast cancer: Comparison of plasma,serum,and tissue VEGF and microvessel density and effects of Tamoxifen.Cancer Res,2000,60(11):2898-2905.

    4  Kautoh O,Takahashi T,Oguri T,et al.VEGF inhibits apoptotic cell death in hematopoietic cells after exposure to chemotherapeutic drugs by inducing MCL1 acting as an antiapoptic factoer.Cancer Res,1998,58:5565-5569.

    5  徐丹，孟凡义，易正山.血管内皮细胞生长因子影响难治性急性髓系白血病发生发展的作用研究.癌症，2003,22(8):844-848.

    6  李晓明，韩建群.VEGF和MDR1在急性髓系白血病中的表达及其与预后关系研究.肿瘤医学,2006,14(2):215-217.

    7  Katoh O,Takahashi T,Oguri T,et al.Vascular endothelial growth factor inhibits apoptotic death in hematopoietic cells after exposure to chemotherapeutic drugs by inducing MCL1 acting as an antiapoptotic factor.Cancer Res,1998,58(23):5565-5569.

    8  Nagata S,Golstein P.The Fas death factor.Science,1995,267:1449-1453.