健脾补血片中阿魏酸的质量浓度测定
作者：胡森科，于燕，张敬华，苗江丽
【关键词】 阿魏酸；健脾补血片；HPLC
摘要：目的 建立健脾补血片中阿魏酸的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法 采用HPLC法。色谱柱Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，C18保护柱；流动相：乙腈0.378mol/L冰醋酸水溶液(30∶70)；检测波长321nm；流速0.8mL/min；柱温：室温；进样量10μL。结果 阿魏酸质量浓度在1.0-10.0mg/L范围内，与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9996)，平均回收率为99.8%，RSD为0.26%。结论 HPLC可用于健脾补血片中阿魏酸的质量浓度测定。
关键词：阿魏酸；健脾补血片；HPLC
Determination of ferulic acid in Jianpibuxue tablets by HPLC
ABSTRACT: Objective To establish a determination method of ferulic acid in Jianpibuxue tablets. Methods HPLC was used with Lichrospher C18(4.6mm×250mm, 5μm) as the column. The mobile phase was a mixture of acetonitrile0.378mol/L acetum (30∶70) and in a flow rate of 0.8mL/min; The detective wavelength was 321nm; Column temperature was room temperature and the injection quantity was 10μL. Results Ferulic acid in samples was well separated. The linear range was 1.0-10.0mg/L(r=0.9996). The average recovery was 99.8% and RSD was 0.26 %(n=6). Conclusion This method can be used for quality control of ferulic acid in Jianpibuxue tablets.
KEY WORDS: ferulic acid; jianpibuxue tablets; HPLC
健脾补血片处方由党参、茯苓、皂矾、神曲茶、黑豆、白术、陈皮、甘草等组成。具有补血、益气、健脾和胃、消积之功能。用于脾虚血少所致的面黄肌瘦，食少体倦等症以及营养性、缺血性贫血及继发性、失血性贫血。为了有效地控制产品质量，对制剂中的主要成分阿魏酸采用高效液相色谱(HPLC)法进行测定。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药 日本岛津LC10AT高效液相色谱输液泵，SPD10AVP紫外可见检测仪，岛津7725i进样器，ANASTAR色谱工作站，DL360超声波清洗器(浙江象山县石浦海天仪器厂，功率240W，频率35kHz)，乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂为分析纯。阿魏酸对照品由药品生物制品鉴定所提供，批号0773-9910。健脾补血片由西安阿房宫制药有限公司提供，批号20030501-20030503。
1.2 对照品溶液的配制 精密称取阿魏酸对照品，用甲醇溶解并制成每mL含阿魏酸0.1mg的对照品溶液，备用。
1.3 供试品溶液的制备 取本品20片，研细，取2.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加甲醇20mL，超声提取30min，滤过，滤渣用甲醇洗涤2次，每次10mL，合并滤液，置70℃水浴蒸干。残渣加0.2mol/L碳酸钠溶液10mL溶解，转入60mL分液漏斗中，用乙醚萃取2次，每次25mL，弃去乙醚相，水相用盐酸(5mol/L)调pH至1-2，再用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚相，水浴蒸干。残渣用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，离心，上清液作为供试液。
1.4 阴性对照溶液的制备 按处方取除党参外的其他几味中药，依处方工艺制成片，再按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件 色谱柱Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，C18保护柱；流动相：乙腈0.378mol/L冰醋酸水溶液(30∶70)，使用前经0.45μm微孔滤膜过滤并脱气；检测波长321nm；流速0.8mL/min；柱温：室温；进样量10μL。 在此条件下，对照品、供试品及阴性样品溶液的色谱图如图1所示。
图1 健脾补血片中阿魏酸的HPLC图谱（略）
Fig.1 HPLC graphs of ferulic acid in jianpibuxue tablets
a: standard; b: sample; c: blank; 1: ferulic acid
2.2 线性关系考察 用甲醇稀释阿魏酸的对照品溶液，制成每1mL含1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg的溶液，进样，记录峰面积，以峰面积A对对照品溶液浓度C作图，进行回归分析，得回归方程为：C=1.314×10-5A+0.064, r=0.9996。说明，在此色谱条件下，阿魏酸质量浓度在1.0-10.0mg/L范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
2.3 供试品溶液制备方法的考察 采用正交实验法对样品浸提体积、超声时间和乙醚提取次数等影响因素进行了考察。
2.3.1 因素水平 A浸提体积(mL)：A1=10，A2=20，A3=30；B超声时间(min)：B1=10，B2=30，B3=60；C乙醚提取次数：C1=1，C2=2，C3=3。
2.3.2 实验方法及结果 同批号样品，研细，精密称取2.5g于100mL锥形瓶中，分别按L9(34)正交表 (表1)进行试验，制得供试品并测定，用统计软件SPSS11.0进行分析处理，结果见表2-4。
表1 阿魏酸提取工艺正交试验L9(34)结果（略）
Table 1 The results of orthogonal test of extraction technology of ferulic acid
表2 阿魏酸提取工艺多因素方差分析（略）
Table 2 Tests of betweensubjects effects for extraction technology of ferulic acid
表3 阿魏酸不同超声提取时间的方差分析表（略）
Table 3 Multiple comparisons of different ultrasonic extracting times
表4 阿魏酸不同乙醚提取次数的方差分析（略）
Table 4 Multiple comparisons of different number of times of extraction using ether
2.3.3 最佳制备工艺的确定 上述实验结果表明，因素A对实验结果无显著性影响，因素B、C有显著性影响；B1与B2、B3之间有显著性差异，B2、B3之间无显著性差异；C1与C2、C3之间有显著性差异，C2、C3之间无显著性差异。考虑到实验操作的便易程度等因素，样品最佳制备工艺为A2B2C3。
2.4 精密度试验 按供试品制备方法制备一份样品，重复进样5次，每次10μL，按上述色谱条件测定峰面积，结果峰面积积分值RSD<2%。
2.5 稳定性试验 按供试品制备方法制备一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12h精密吸取10μL，按上述色谱条件测定，记录峰面积积分值，结果峰面积积分值的RSD<1%，表明供试品溶液在12h内稳定。
2.6 重复性试验 取同批样品5份，按供试品制备方法制备样品并测定，结果RSD<1%。
2.7 回收率试验 采用加标回收法，取已知含量样品6份，分别精密加入阿魏酸对照品，按供试品制备方法制备样品并测定，结果阿魏酸回收率平均值为99.8%，RSD为0.26%，表明回收率良好。
2.8 样品测定 按供试品溶液的制备方法分别测定不同生产批号的三批样品，结果三批样品含阿魏酸的量在4.978-8.957μg/g间。
3 结论
HPLC法测定中药制剂中阿魏酸质量浓度的流动相主要有甲醇水[12]和乙腈水[3]体系。本文对两种流动相体系进行了比较，结果在Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱上乙腈水体系的分离效果优于甲醇水体系，考虑到阿魏酸的分子结构特点，加入适量的醋酸使得阿魏酸的峰形更好。通过HPLC指纹色谱定性[6]以确定制剂和药材中阿魏酸在色谱图中的位置。通过正交试验L9(34)对阿魏酸的提取工艺进行了优化，为测定健脾补血片中阿魏酸的质量浓度提供了一个可靠的方法，以利于健脾补血片的质量控制。
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