复方虫草制剂延长猪同种异体移植皮存活期的实验研究
作者：程代薇，邹勇，钱宁，王朝亮，田应彪，王达利，赵桂香，高振宇
【关键词】 冬虫夏草
［摘要］ 目的：在猪同种异体皮肤移植中，采用由冬虫夏草和昆明山海棠制成的复方虫草制剂（compound of Cordyceps sinensis and Tripterygium hypoglaucum, CSTHC）进行移植皮片的孵化和局部外涂，观察CSTHC对移植皮片存活时间的影响，并探讨其作用机制。方法：采用CSTHC水煎剂浸泡孵化供体猪皮片，然后进行皮片移植，局部外涂CSTHC软膏。以环孢素A（cyclosporine A, CsA）和生理盐水作为对照，观察移植皮片的存活情况。移植术前及术后检测外周血白细胞计数、肝肾功能；观察移植皮片及睾丸的组织学表现；采用免疫组织化学法检测各组移植皮片CD4+、CD8+ T细胞的表达。结果：CSTHC组移植皮片的存活时间为（28.50±3.26）d，较模型组（10.60±1.52）d明显延长，差异有统计学意义；与CsA组（28.33±3.50）d比较，则无统计学差异。移植术后第7、14天，CSTHC组移植皮片局部CD4+、CD8+ T细胞浸润表达低于模型组，差异有统计学意义；与CsA组比较则无统计学差异。移植术后第7天，模型组外周血白细胞计数明显高于CSTHC组及CsA组，差异有统计学意义。结论：局部应用CSTHC可以明显延长移植皮片的存活时间，且无明显的毒副作用。其抑制移植皮片免疫排斥反应的机制可能与减少移植皮片局部炎性细胞尤其是CD4+、CD8+ T细胞的浸润有关。
［关键词］ 冬虫夏草; 同种异体移植; 皮肤移植; 组织存活; 免疫排斥
Effects of compound preparation of Cordyceps sinensis and Tripterygium hypoglaucum on survival time of pigskin after allogeneic transplantation
ABSTRACT Objective: To investigate the effects of compound preparation of Cordyceps sinensis and Tripterygium hypoglaucum (CSTHC) on survival time of grafted pigskin after allogeneic transplantation and its mechanism. Methods: The pigskin was treated with CSTHC solution before allogeneic transplantation, and CSTHC ointment was applied for external use on the grafted pigskin after skin transplantation. Cyclosporine A (CsA) and normal saline were served as control. The survival time, the appearance and the histomorphological changes of the grafted pigskin were observed. The histomorphological changes of testicles in pigs were also examined. The CD4 and CD8 expressions in the grafted pigskins were measured by immunohistochemical method. The white blood cell count in peripheral blood and the liver and renal functions were also examined. Results: The survival time of the grafted pigskin in the CSTHCtreated group was (28.50±3.26) d, which was much longer as compared with (10.60±1.52) d in the untreated group (P＜0.01). The survival time of the grafted pigskin in the CsAtreated group was (28.33±3.50) d, and there was no remarkable difference in the survival time of the grafted pigskin between the CsAtreated group and the CSTHCtreated group. The expressions of CD4 and CD8 were lower in the CSTHCtreated group than those in the untreated group on the 7th and 14th day after skin graft (P＜0.05), while there was no significant difference in the indices between the CSTHCtreated group and the CsAtreated group. The WBC count was higher in the untreated group than that in the CSTHCtreated group or CsAtreated group on the 7th day after skin graft (P＜0.05). Conclusion: CSTHC can prolong the survival time of allogeneic grafted pigskin. Its mechanism of inhibiting the immunological rejection may relate to decreasing the expressions of CD4+ and CD8+ in the grafted pigskin and reducing the local inflammatory reaction.
KEY WORDS Cordyceps sinensis; allograft; skin transplantation; tissue survival; immunological rejection
异体皮肤移植是烧伤早期进行创面覆盖的重要方法，如何减轻免疫排斥反应、延长移植物的存活时间一直是研究的热点。本研究采用冬虫夏草（Cordyceps sinensis, CS）和昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum, TH）制成虫草复方制剂（compound preparation of Cordyceps sinensis and Tripterygium hypoglaucum, CSTHC），在猪同种异体皮肤移植过程中用于孵化皮片和局部外涂，通过观察CSTHC对移植物存活时间的影响及检测移植皮肤局部CD4+及CD8+ T细胞的浸润表达情况，探讨CSTHC延长猪同种异体移植皮片存活期的的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 供体猪：健康家猪1只，雄性，体质量78 kg。受体猪：贵州小型白香猪17只，3月龄，体质量（15±2.5）kg。17只白香猪随机分为3组：CSTHC组（6只）、环孢素A（cyclosporine A, CsA）组（6只）和模型组（5只）。
1.2 药剂制备 选用青海产野生型CS 30 g及贵州独山产TH 60 g，制成水煎剂600 ml，分别含CS 5%及TH 10%。取300 ml加入氮酮（azone）3 ml，用NaCl调节渗透压后制成孵化液。另300 ml加入氮酮及丙二醇各10 g，再加入软膏基质混合制成300 g软膏。另按上法配制0.1 % CsA孵化液及CsA软膏。采用生理盐水配制模型组孵化液及软膏。
1.3 皮肤移植 取供体猪中厚皮片3份，在各组预热的孵化液中孵化1 h后，移植于各组受体猪的一侧胸腹部，每猪移植9片，每片4.0 cm×4.0 cm。移植术后第8天起，各组受体猪采用相应软膏外涂植皮区，1次/d。
1.4 移植皮片存活情况观察 移植皮片红润有光泽，视为皮片成活；若失去光泽呈苍白或暗褐色，且干枯面积＞2/3，视为皮片坏死。
1.5 标本采集及指标检测 移植术前及术后第7、14、28天分别抽取受体猪外周血，检测外周血白细胞（white blood cell, WBC）计数、丙氨酸氨基转移酶及肌酐的水平。移植术后第14天取各猪移植皮片组织制成石蜡块，于－80 ℃保存，每个石蜡块制成5张切片，其中1张采用苏木素伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色进行组织学观察；另4张用丙酮（4 ℃）固定后，采用CD4、CD8单抗分型试剂盒（购自武汉博士德生物工程公司）进行检测，镜下阳性表达表现为细胞膜、细胞质内呈现棕黄色颗粒，显微镜下（×400）每张切片选取4个视野，进行阳性细胞计数，取其平均数作为阳性表达值。移植术后第28天取雄性受体猪睾丸组织，制成石蜡切片，采用HE染色进行组织学观察。
1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，同组内比较行自身对照t检验，两组之间采用组间比较t检验。
2 结果
2.1 移植皮片存活情况及组织学观察 移植术后第9天起，模型组皮片逐渐坏死，至第13天全部坏死；此时，CSTHC组及CsA组移植皮片存活情况良好。移植术后第3～4周起，CSTHC组及CsA组移植皮片相继出现免疫排斥反应，分别于术后第34天及第35天全部坏死。CSTHC组移植皮片平均存活时间为（28.50±3.26）d，较模型组（10.60±1.52）d明显延长，差异有统计学意义；CSTHC组移植皮片平均存活时间与CsA组（28.33±3.50）d比较，则无统计学差异。移植术后第14天，模型组移植皮片有大量炎性细胞浸润，组织结构不清；CSTHC组及CsA组移植皮片炎性细胞浸润少，皮肤结构清晰。见图1～4。
2.2 移植皮片局部CD4+、CD8+ T细胞浸润表达情况 移植术后第7、14天，3组移植皮片局部CD4＋、CD8＋表达较术前均有明显提高，差异有统计学意义；但CSTHC组及CsA组的表达均低于模型组，差异有统计学意义；CSTHC组与CsA组比较则无统计学差异。移植术后第28天，模型组移植皮片已坏死。见表1。
图1 移植术后第14天模型组移植皮片存活情况（略）
Figure 1 Grafted pigskin appearance in untreated group on the 14th day after allogeneic transplantation
图2 移植术后第14天CSTHC组移植皮片存活情况（略）
Figure 2 Grafted pigskin appearance in CSTHCtreated group on the 14th day after allogeneic transplantation
图3 移植术后第14天模型组移植皮片组织学表现（HE染色，×400）（略）
Figure 3 Histomorphological changes of grafted pigskin in untreated group on the 14th day after allogeneic transplantation (HE staining, ×400)
图4 移植术后第14天CSTHC组移植皮片组织学表现（HE染色，×400）（略）
Figure 4 Histomorphological changes of grafted pigskin in CSTHCtreatedgroup on the 14th day after allogeneic
transplantation (HE staining, ×400)
表1 移植术前及术后不同时间各组移植皮片CD4＋、CD8＋表达的比较（略）
Table 1 Numbers of CD4+ and CD8+ T cells in grafted pigskin before and after allogeneic transplantation in 3 groups
*P＜0.05, vs the same group before transplantation; △P＜0.05, vs untreated group at the same time.
2.3 其他指标检测结果 移植术后第7天，模型组外周血WBC计数（39.56±4.14）×109/L，明显高于CSTHC组（21.95±1.74）×109/L及CsA组（22.93±3.61）×109/L，差异有统计学意义（P＜0.05）；血丙氨酸氨基转移酶及肌酐水平各组之间比较则无明显差异。移植术前及术后第28天睾丸组织学检查，各组均表现为曲细精管及间质结构形态清晰，并有精子生成。
3 讨论
皮肤是免疫原性最强的组织之一。为了减轻免疫排斥反应、延长移植皮肤的存活时间，在啮齿动物中曾做过许多实验，如在移植前给受体注射去除了抗原呈递细胞（antigenpresenting cells, APC）的供体脾细胞，给受体注射特异性的CD4＋ T淋巴细胞抗体或疫苗以及用雷公藤孵化皮片等［1,2］，取得了一定的疗效。猪的结构及功能与人类非常接近，被认为是最佳的异种移植供体［3］，但有关这方面的研究却鲜见报道。因此，研究猪的免疫排斥反应机制及其防治措施有着重要的意义。
有报道认为，在研究延长异体植皮存活期措施时须注重局部处理，尽量避免其明显的毒副作用［4］。CS能抑制小鼠脾细胞对刀豆蛋白A（concanavalin A, ConA）和细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激而产生的淋巴细胞转化，还能抑制迟发性超敏反应［5,6］；TH能抑制网状内皮系统的吞噬功能，抑制特异性抗体的生成，但副作用较大［7,8］。将这两种中药组合制成虫草复方制剂，经实验证实有抑制淋巴细胞增殖及减少CD4＋、CD8＋表达的作用［9］。将其制成孵化液和软膏外用，可减少药物对全身免疫系统的影响。本实验结果显示，CSTHC组外周血WBC计数、丙氨酸氨基转移酶及肌酐水平均未见明显异常；且未观察到TH的抗生育作用，提示局部使用CSTHC是较为安全的。
Bach等［10］报道，猪异体皮肤移植后第7～11天将出现排斥反应。本实验结果显示，用CSTHC孵化皮片及外用软膏可使猪异体皮片存活时间延长至（28.50±3.26）d，而CsA组为（28.33±3.50）d，提示CSTHC作用强度与CsA相当；模型组移植皮片有大量炎性细胞浸润，且CD4＋、CD8＋的表达均较CSTHC组与CsA组明显；CD4＋、CD8＋的表达与移植皮片的存活时间呈负相关。因此推测，CSTHC延长移植皮片存活时间的主要机制为抑制细胞免疫，降低免疫排斥反应的速度。本实验亦证实异体移植排斥反应中T淋巴细胞起着至关重要的作用，CD4＋和CD8＋ T细胞的局部浸润情况可反映免疫排斥反应的强弱［11,12］。同时，CSTHC组在移植术后第7天外周血WBC计数明显低于模型组，表明CSTHC亦有一定的抗炎作用。
［］
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